糖尿病大鼠模型神经传导阻滞的超声工具

本工作提出了应用高强度聚焦超声阻断糖尿病神经病理性神经动作电位的方法。

近年来, 在正常和糖尿病动物模型中, 采用高强度聚焦超声 (HIFU) 传感器进行神经传导阻滞。HIFU 在使用适当的超声参数时, 可以在不损伤神经的情况下可逆地阻断周围神经的传导。神经活动电位的暂时和部分阻滞表明, HIFU 有潜力是一个有用的临床治疗疼痛缓解。这项工作演示了用 HIFU 换能器抑制糖尿病大鼠神经病理性神经的动作电位的方法在体内。第一步是通过注射链脲佐菌素生成成年男性糖尿病神经病理性大鼠。第二步是通过电子弗雷探针和热板对糖尿病大鼠周围糖尿病神经病变进行评价。最后一步是记录在体内暴露于 HIFU 超声的神经的胞外动作电位。该方法可为超声镇痛应用研究带来有益的结果。

口服药物, 针灸¹, 和电神经刺激²已被用于治疗痛苦的糖尿病神经病。然而, 口服药物的副作用、针刺的侵入性操作、电神经刺激对治疗效果和患者的依从性都有影响。超声在动物模型中的周围神经阻滞已被调查了几十年^3,4,5。对 0.4-1.0 s ⁶的 10-20 脉冲超声照射后, 大绿蛙的坐骨神经进行了可逆性抑制。阻断神经传导的一个因素是超声⁷引起的温升。对于神经病的患者, 在低强度超声照射下, 腓神经对复合肌肉动作电位 (CMAPs) 的抑制作用为 2 min⁸。完全恢复时间在5分钟以内。

最近, 美国食品和药物管理局批准 HIFU 作为非侵入性治疗子宫肌瘤肿瘤⁹, 疼痛 palliations 骨转移的¹⁰, 和前列腺癌¹¹。HIFU 传感器在体外发出声束, 光束在不同的组织介质中传播, 并会聚在靶肿瘤的焦点上。在不损害周围组织的情况下, 立即形成病灶区, 对靶向肿瘤产生局部效应。HIFU 也已被用于抑制神经传导或导致神经失神经在体内实验正常的大 (SD) 大鼠¹²。此外, 研究了 HIFU 对神经病理性神经的短期和远期影响,¹³。以往的结果表明, 可逆转或永久块的感觉神经传导可以实现的 HIFU 与适当的参数。除了镇痛应用外, HIFU 还可作为研究神经传导阻滞的重要因素, 以此为基础, 探讨神经病学和疼痛药物的发展。因此, 需要在动物模型中专门针对周围神经的 HIFU 阻断技术平台。本文旨在通过 HIFU 对糖尿病神经病理性大鼠部分或完全阻断外周神经动作电位的方法进行研究。建立糖尿病大鼠模型, 评价周围神经病理性症状。本文介绍了一种专门用于治疗大鼠坐骨神经的 HIFU 平台和实验过程。

台湾国家卫生研究院机构动物保育与使用委员会批准了所有动物协议.

1. 糖尿病模型在成年雄性大 (SD) 大鼠中的诱导作用

1. 将从笼中取出的大鼠食品颗粒从笼子中移到快速雄性 SD 大鼠 (300-350 g), 用于6小时前的脲嘧啶诱导.
2. 制备柠檬酸钠缓冲液 (0.1 米, pH 4.5)。
   1. 溶解1.05 克柠檬酸一水合物 (C ₆ h ₈ o ₇ 和 #183; h ₂ o; 摩尔. 210.14) 在50毫升蒸馏水中做一个0.1 米柠檬酸溶液.
   2. 溶解 1.47 g 三钠柠檬酸二水合物 (C ₈ H ₅ O ₇ Na ₃ 和 #183; 2H ₂ O; 摩尔. 294.12) 在50毫升蒸馏水中制造0.1 米柠檬酸钠溶液.
   3. 将25毫升柠檬酸溶液添加到25毫升枸橼酸钠溶液中。使用 ph 计监测柠檬酸钠缓冲 ph 值 (ph 值 4.5).
      注: 通过加入适量的0.1 米枸橼酸钠溶液使缓冲液成为等渗.
3. 在0.1 米的柠檬酸钠缓冲液中溶解脲佐菌素, 生成50毫克/毫升的脲佐菌溶液.
   注: 脲佐菌素溶液是光敏的, 因此, 在 15-20 min 的范围内用铝箔覆盖该溶液并使用.
4. 在1毫升的胰岛素或结核菌素注射器中, 用26到28口径的针将50毫克/千克的脲佐菌素溶液抽出. #160; 用乙醇垫和腹腔将注射部位清洁, 将该溶液注入腹部下右象限, 以避免损伤腹部器官。和 #160;
5. 在注射用10% 蔗糖水作为唯一的水源后48小时, 以防止低血糖.

2. 糖尿病的确认在脲佐菌素诱发大鼠中的作用

1. 监视在 72 h 和葡萄糖米后注射的所有大鼠的空腹血糖浓度。
   1. 在测量空腹血糖水平之前, 快速将糖尿病大鼠诱导为15小时.
   2. 在血糖测量过程中, 将老鼠放在一个约束袋里, 并露出尾巴进行血液收集.
   3. 用血柳叶刀刺破尾巴尖端, 以获得一滴血。将滴血放在葡萄糖试纸上。记录空腹血糖水平.
      注: 葡萄糖仪检测并显示单位为毫克/dL 的血糖水平。在2周的诱导后, 将空腹血糖水平低于150毫克/dL 的大鼠排除在外.

3。糖尿病大鼠周围性糖尿病神经病变的评价

1. 使用电子痛评估机械性的小弗雷。
   1. 习惯在对1厘米直径金属网格地板上的笼中的糖尿病大鼠进行30分钟的观察后, 再评估后爪提取反应.
   2. 使用带有刚性尖端 (直径 0.8 mm) 的电子式弗雷探针, 手动将压力施加到大鼠后爪的足底表面, 并逐渐增加压力, 直到看到爪子的撤退反应.
   3. 记录在系统上显示的压力并重复测量每只老鼠5次, 每次测量间隔为三十年代.
2. 用热板评估热痛觉过敏。
   1. 习惯在评估疼痛反应之前, 在热板 (24 和 #177; 0.5 和 #176; C) 中对糖尿病大鼠进行10分钟的实验.
   2. 在适应后将老鼠放回笼子里, 加热热板, 保持热板和 #39 温度在55和 #177; 0.5 和 #176; C.
   3. 将老鼠放在加热的热板上, 同时启动计时器.
   4. 当老鼠表现出明显的行为时, 如舔后爪或不正常地弹后腿, 停止计时器, 并记录撤退的潜伏期.
      注: 如果鼠在二十年代 (二十年代截止时间) 后不表现出明显的行为, 请终止热板试验, 并将大鼠从热板中取出.

4。 在体内 用 HIFU 换能器进行神经传导阻滞

注意: 在50毫克/千克注射后, 体内 实验开始于5周.

1. 在用 HIFU 超声 CMAPs 之前执行动物程序。 在手术前,
   1. 在高压釜中消毒手术工具 (手术刀、剪刀、镊子和玻璃钩).
   2. 麻醉鼠腹腔注射 tiletamine/唑合剂 (40 毫克/千克) 和嗪 (10 毫克/千克) 或 通过 吸入1.75% 的异氟醚通过异氟醚蒸发器。将老鼠放在加热垫上以保持体温.
   3. 在腹卧床中放置大鼠进行手术。涂抹眼药膏。延长鼠腿, 用指甲捏足足底表面, 以确定麻醉深度。如果老鼠表现出戒断反应, 应用额外的麻醉.
   4. 用电动剪刀将老鼠的大腿和下背部的毛发移除。在手术部位用干净的纱布涂抹液体碘, 并在手术部位向外循环移动纱布。用酒精垫用相同的圆周运动擦拭液体碘。这个实验是在左侧和右侧的手术部位进行的。在执行下一步的步骤时, 在其他外科手术部位重复此步骤.
   5. 使用无菌手术剪刀或手术刀, 使背部大腿的皮肤切开。使用钝器手术剪刀仔细分离皮肤下面的组织和保护皮肤与皮肤挂钩. #160 股骨可以在肌肉中看到.
   6. 使用剪刀仔细分离肌肉平行于股骨, 直到大腿的坐骨神经纤维, 是嵌入在肌肉是可见的。小心地用玻璃钩把大腿坐骨神经从周围的结缔组织和肌肉中分离出来.
2. 使用 custom-made 神经固定器 ( 图 1 和 图 3 ) 在 HIFU 焦点区域定位坐骨神经.
   注意: custom-made 神经固定器由3组件组成 ( 图 3 )。所有组件均由透明酯 (PMMA) 制成。组件顶部结构的外螺纹为 2.5 mm 高, M10XP0.7 ( 图 4A )。中央井是一个4.0 毫米直径孔通过组分 i。井的底部开口由一张胶带密封。槽的直径是1.2 毫米, 并且槽的中央平面和组分 I 的顶面之间的距离是3.1 毫米. 组分 II 包括一个主要身体, 四条腿和底部结构 ( 图 4B )。底部结构的内螺纹为2.5 毫米高, M10XP0.7, 以适应组件的外部螺纹。中心孔的直径与构件 i. 的中心井相同主体的尺寸为32毫米直径和5.4 毫米的厚度。四条腿对称地被部署。两个相同的短腿设计为对齐和两个相同的长腿工作挂钩的组件 III。组分 III 的外径和高度是41毫米和9.2 毫米。内螺纹为 M36XP1.0, 通孔直径为27.5 毫米 (强类 = "xfig">> 图 4C )。锥是一个中空的锥形, 顶部开口直径84毫米, 直径27.5 毫米的底部开口。高度为 57.5 mm ( 图 5A )。
   1. 在实验前, 将 custom-made 丙烯酸神经固定器浸泡在漂白液中 30-60 分钟, 然后浸泡在无菌水中.
   2. 使用玻璃钩, 小心地提起神经, 并把它放在组件的插槽 i.
   3. 螺丝组件 II 到组件 i. 用林格和 #39 的方法来填充中心井, 用于超声传播和神经保护.
   4. 螺杆组件 III 至 HIFU 外壳锥。通过组件 II. 的四条腿将组件 III 与组件 II 结合起来
      注: 三元件的几何中心和传感器对齐。神经和换能器之间的距离等于焦距, 从而保证了神经在 HIFU 聚焦区的内部.
3. 将一双针刺针插入坐骨神经的原点, 另一对进入腓肠肌。通过一根同轴电缆将每对针连接到电生理采集系统 ( 图 1 ).
   注: 在电缆的一端是两个鳄鱼夹子分别夹住两根针, 另一端是连接系统的 BNC 连接器。在坐骨神经和腓肠肌的记录电极上, 对针灸针的作用是刺激电极。
   1. 将电生理学采集系统的采样率和带宽分别设置为50赫和 70 Hz-3 赫。应用一个超极大刺激与脉冲宽度0.1 毫秒的刺激电极在坐骨神经的起源.
   2. 记录 CMAPs 从记录电极和放大 CMAPs 与内置放大器的电生理采集系统.
      注: 在电生理采集系统中使用内置放大器, 放大神经信号, 并通过电生理采集系统记录电极 CMAPs.
4. 使用商用 2.68 MHz HIFU 传感器来抑制糖尿病神经病理性大鼠的 CMAPs.
   注: 换能器的规格说明如下: 元素球形碗, 孔径直径为6厘米, 焦距为5厘米, 在自由场中有4毫米深的椭圆形焦带和0.8 毫米的宽度。
   1. 将球形锥、HIFU 换能器和锥盖浸没在装有脱水的水箱中。将 HIFU 换能器放入球面锥中, 用6头螺钉 ( 图 5B ) 将锥盖固定在球面锥的顶部开口上。在球形锥体的气泡自然地被逐出了由于低气泡的密度与水相比, 封印 front-end 打开锥体由一个透明0.03 毫米厚实的磁带。螺丝组件 III 到球面锥上.
   2. 从脱水箱中取出球面锥和组件 III 的 HIFU 传感器.
      注: 研究中使用的反渗透水是由反渗透过程净化的水。反渗透水煮沸, 以排出气体。冷却后, 脱水在单个密封罐中获得.
5. 将组件 i 放入神经和肌肉之间的空间, 并将神经放置在组件的间隙中. 执行步骤4.2.3 和 4.2.4, 以确保神经在 HIFU 的焦点区域内 ( 图 3 a/强 >>).
6. 连接函数发生器和射频功率放大器。将功率放大器与 hifu 换能器连接, 以产生 hifu 光束。手动设置功能发生器的电压输出到 HIFU 传感器 通过 功率放大器。在 HIFU 曝光时间过后, 手动关闭函数发生器。使用计时器观察时间.
   注: 本研究中使用的 HIFU 光束的强度和能量分别为2810瓦特/厘米 ² 和 84 J/mm ² .
7. 同时, 通过电生理采集系统 (步骤 4.3) 和 hifu 光束通过 hifu 系统 (步骤 4.6) 向坐骨神经传递刺激, 同时记录 CMAPs。从 3 s、5 s 到8秒逐渐增加 HIFU 对坐骨神经的照射, 直到 CMAPs 的振幅减小或抑制。
   1. 在 HIFU 光束交付期间每秒记录一次 CMAPs。观察了 CMAPs 振幅的变化, 关闭了 HIFU 系统, 并手动点击了电生理学采集软件上的记录图标, 记录 CMAPs 在10分钟的每2分钟, 每5分钟在连续30分钟, 每10分钟最后一个阶段, 直到录制时间达到 2 h.
8. 分离神经固定器的第二和第三部分 ( 图 3 ), 从切口部位卸下 HIFU 传感器。分离的第二部分和 i 释放安全的坐骨神经。在记录 CMAPs 后, 用4-0 张铬线缝线缝合糖尿病大鼠的手术部位。将液体碘应用于手术部位以防止感染。
   1. 将笼子放在加热垫上, 让老鼠在笼子里恢复, 然后再将它们送回动物设施。在饮用水中提供布洛芬3天或腹腔注射丁丙诺啡 (0.05-0.1 毫克/千克).
9. 在最初的 HIFU 超声后的4.1.2 和4.3 天7、14和28中的步骤中描述了在麻醉性糖尿病神经病鼠坐骨神经和腓肠肌的起源中插入刺激和记录电极。重复步骤4.3.1 到4.3.2。
   1. 将笼子放在加热垫上, 允许老鼠在将笼子移到动物设施之前在笼子里恢复.
10. 在实验后安乐老鼠。把老鼠放在二氧化碳室里。等待约5分钟的老鼠停止呼吸。确保心脏停止跳动.

在体内研究表明, HIFU 剂量为 3 s 超声在强度为2810瓦特/厘米², CMAPs 被抑制20% 的基线, 但他们完全恢复后, 30 分钟 (图 2A, 钻石) 和几乎在28天 (图 2B, 菱形) 期间的常量。对于 5 s HIFU 暴露在相同强度, CMAPs 下降到 65.4% (9.5%) 的基线在4分钟, 恢复到 73.7% (12.6%) 的基线, 120 分钟 (图 2A, 正方形)。CMAPs 直到14天 (图 2B、正方形) 才返回到基线水平。当 HIFU 超声时间在相同强度下增加到8秒时, CMAPs 在 4 min (图 2A, 三角形) 下降到 26.0% (14.1%) 基线, 但在 38.0% min 时增加到 12.0% (120) 的基线, 并逐渐增加到74% 的基线, 按天28 (图 2B, 三角形)。有关其他详细信息, 请参见 Lee, 许贤,¹³ 。

图 1: 实验性设置在体内高强度聚焦超声 (HIFU) 的神经传导阻滞.(a)用反渗透脱水与神经固定器结合在一起的 custom-made 丙烯酸球形锥, 以确保 HIFU 传感器的焦点区域位于神经的焦平面上。图中显示了(B)刺激和记录电极。神经固定器定位在 HIFU 束的焦平面上的坐骨神经。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 在中的 CMAPs 响应在体内糖尿病神经病理性大鼠 3 s, 5 s, 和 8 s 的 HIFU 超声.(A) CMAPs 在1天录音期间的时间路线。在 3 s、5 s 和 8 s 的 HIFU 超声后, CMAPs 在10分钟内减少, 并在120分钟后恢复, (B)在7、14和28录音中的 CMAPs 的时间路线。CMAPs 在 3 s 和 5 s hifu 超声在天1以后完全地被恢复了14天和部份地增加了 28 s hifu 超声。金刚石: 3 s hifu 超声, 正方形: 5 s hifu 超声, 和三角形: 8 s 的 hifu 超声。n = 6 用于每个 HIFU 参数。* Significantly 与1天不同。数据被表示为中值 (范围), 其中误差条是该范围的一半。此图是从 Lee, 许贤, 2015¹³中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 在 HIFU 热斑中确保坐骨神经的组装过程.(A)三装配步骤如下所示: (1) 仔细解决元件 i 的插槽中的神经, (2) 组装元件 II 和元件 i, (3) 将 front-end 的部件与 HIFU 传感器锥结构插入元件 II。(B)与大鼠神经结合的 HIFU 传感器示意图。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 第一部分 (a)、第二 (B) 和第三 (C) 项的绘图.请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 球面锥 (a) 和锥盖 (B) 的图形.请单击此处查看此图的较大版本.

对糖尿病大鼠神经病理性神经作用电位的局部和暂时性抑制, 并观察了 HIFU 治疗后的阻滞作用的即刻发生. 为期28天的 CMAPs 随访研究表明, 可以在适当的 HIFU 照射下进行神经传导的安全阻断。因此, HIFU 治疗的上述协议可以为糖尿病大鼠坐骨神经可逆传导阻滞提供一种替代方案。

在这种方法中, 没有神经变性, 感觉神经可以完全恢复在一个小时到几天的轻度神经损伤¹⁴。对于严重的损伤, 感觉恢复的时间过程通常需要几个月, 如果它发生在所有。此外, 当神经管和雪旺细胞基底板在粉碎伤后完好无损,¹⁵后, 周围神经纤维再生更完整。因此, 我们推断 hifu 治疗导致轻度但可逆的神经损伤的情况下, 因为抑制 CMAPs 后, hifu 处理返回基线随着时间的推移。对于严重的神经损伤, CMAPs 只恢复部分, 即使在28天之后。

本研究的技术为研究 HIFU 对周围神经的影响提供了实验平台。由于本研究中所开发的结构成分和协议, 可以精确地对准目标神经, 从而解决了以往的定位问题。除正常神经外, HIFU 阻滞技术也可应用于病变神经。然而, 目前的技术的局限性包括缺乏温度监测 (导致周围组织的损伤) 和短暂的阻滞作用, 虽然重复 HIFU 暴露可能延长镇痛。为了将 hifu 阻断技术转化为临床试验, 需要对 hifu 聚焦区进行无创导引, 如超声成像或 mr 成像, 以确定靶组织的位置并实时监测温度。

现有的口服药物治疗结果只有1/4 例神经病理性疼痛经验超过50% 疼痛缓解, 并造成一些重要的副作用, 如嗜睡, 头晕和嗜¹⁶。物理模式的发展, 希望提高镇痛功效, 如针灸, 电和磁刺激。然而, 针灸的功效很大的依赖于临床医生的经验, 而这一过程是具有侵入性的。无创电刺激或磁刺激的功效约为2小时疼痛自由的40%。这两种刺激都不集中在本地站点上, 这会产生一些不良事件¹⁷。因此, 为了满足临床未满足的周围疼痛缓解的需要, HIFU 阻断技术是一种有前途的工具, 因为即时的效果, 可逆的效果, 物理治疗, 非侵入性治疗, 和潜在的家用。

准确地瞄准坐骨神经的 HIFU 聚焦区是至关重要的。图 3演示了将神经定位到焦点区域的示意图过程。第一步是用一个玻璃钩稍微抬起坐骨神经, 并把我的神经下的组成部分, 然后放下神经到插槽的组成部分 i (图 3A)。通过第一步, 神经通过了组件 I 的中心点。第二步是组装组件 II 与组件 i通过螺钉盖结构。第一和第二部分的组装是图 2B中显示的神经固定器。组件 II 扮演连接组件 I 和 III. 的角色在组合第二和 III 组分之前, 他们充满了脱气林格的解答传送超声并且保留神经。最后一步是插入组件 III front-end 结构的 HIFU 传感器锥耦合器到组件 II。二对灵活的长和短的支柱组分 II 提供足够的固定力。根据榫榫原理设计了第二和 III 组件的装配, 保证了三元件的中心点在轴上。HIFU 换能器的焦距等于换能器中心点和元件中心点之间的距离。因此, 神经肯定是在焦带内, 这是一个椭圆形, 宽度为0.8 毫米, 深度为4毫米。

作者没有什么可透露的。

这项研究得到了科学技术部 (最多 105-2221-400-001) 和台湾国家卫生研究院 (项目 BN-105-PP-10) 的支持。