急性肺损伤开放气管切开胃酸吸入小鼠模型结果在急性最大非致命性肺损伤

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

酸肺炎是无菌的急性肺损伤（ALI）的主要原因在人类。酸肺炎跨越临床谱从无症状到急性呼吸窘迫综合征（ARDS），其特征在于嗜中性肺泡炎，和伤害到两个肺泡上皮和血管内皮。在临床上，急性呼吸窘迫综合征是由低氧血症急性起病，双侧斑片状肺浸润和非心源性肺水肿定义。人类研究为我们提供了有关引起ARDS肺中的生理和炎性变化，这导致了对下属机制各种假说有价值的信息。不幸的是，在确定ARDS的病因，以及广泛的病理生理学的困难导致缺乏可能是在开发治疗策略有用的关键信息。

平移动物模型是有价值的，当他们发病机制和病理生理学准确reproducEA概念在体外和临床证实。虽然大动物模型（ 如羊）人的气管，支气管树的解剖结构的共同特征，小鼠模型提供的其他优势，包括主机:成本低;繁殖周期短借贷本身更大的数据采集;一个很好的理解免疫系统;和充分表征的基因组，导致的各种基因缺失和转基因的菌株的可用性。低pH诱导的急性呼吸窘迫综合征的鲁棒模型需要鼠ALI靶向主要肺泡上皮，其次的血管内皮，以及小气道导致肺泡。此外，不同的伤害性和非伤害性的侮辱之间的巨大差异可重复的伤害是很重要的。

用盐酸这里介绍的鼠胃酸误吸模型采用开放式气管切开术，并再现了致病场景，再现低pH pneumonITIS在人体的伤害。此外，该模型可用于研究低pH损伤与其它肺损害的实体（ 例如 ，食物颗粒，致病菌）的相互作用。

急性呼吸窘迫综合征的特点是广泛的肺部炎症和临床上被视为呼吸短促急性低氧血症。这些症状通常是煽动事件发生后不到24小时，如外伤，败血症，输血相关反应或愿望。它被定位于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞，导致蛋白质漏出，随后透明膜形成中性粒细胞肺泡炎（ 即广泛的炎症）组织病理学特点。吸入被归类为化学性肺炎或吸入性肺炎。 ¹胃吸出的酸性成分有助于肺炎和偏好都制定了继发性细菌性肺炎。吸入性肺炎是ALI和ARDS的后续发展的主要风险因素之一。 ²

胃愿望是定义为从T物料吸入急性事件他带或不带口咽部菌群到气管超出声带胃。在抽吸内容物可以包含低pH的胃流体，细菌，血液或食品颗粒。胃吸出患者常发生在重症监护病房（ICU），其中通常是在空腹状态，因此放置在一个质子泵抑制剂限制酸化胃内容物误吸。比起一般患者群高5倍 - 急性肺损伤在美国ICU的人口的发病率是2.5。 ³遗憾的是，这些易患因素往往会导致胃内细菌过度生长的状态，可能会导致下面的一个愿望事件肺部更严重的后遗症，如胃的愿望是继发细菌性肺炎发展的一个独立危险因素（SBP） ，ALI和急性呼吸窘迫综合征。

胃抽吸具有两个主要部分组成:盐酸和胃内容物，其可以或可以不含有细菌或食物颗粒。在啮齿动物模型单独胃抽吸的酸成分产生一个初始炎症应答作为对气道上皮低pH的直接苛性损伤的结果。这之后是中性粒细胞浸润，并在4炎性反应 - 6小时。 ⁴这两个因素最终导致的肺微血管完整性从而导致流体和蛋白质外渗进入肺泡和呼吸道破坏。要理解本病理生理学和进一步研究可能的治疗干预，开发和表征即阐明涉及的基本机制的动物模型是重要的。单独的酸性抽吸必须庞大或具有足够低的pH值以绕过呼吸树的缓冲能力和到达肺泡。如果这不发生，只发生瞬态上，传导气道损伤，从而不太可能导致ARDS的严重后遗症。 ^{5 <}/ SUP>

为了准确地与受伤的肺泡上皮仿真抽吸事件，绕过动物的天然防御很重要。利用小鼠模型的愿望，产生ALI模仿人类看到的胃酸的伤害，必须占气管支气管树的差异。开气管切开术，该方法利用绕过损伤重现ALI既生理学和组织学的方式鼠和人的呼吸的树木和模型之间的差异。从历史上看，气管内插管用于生成ALI，然而它被认为是困难的小鼠未经喉损伤来执行。因此，这种方法提供了已取得在多个研究人员和以最小的过程归因死亡率一致的结果的潜在替代。

所有的材料和设备需要收集和适当前程序组织的。该过程是要以无缝转换从一个步骤到下一个，以便提供一致的，可重现的数据进行的。该协议遵循的机构动物护理和使用委员会在水牛城退伍军人医疗中心设置机构政策。
注意:两个雄性和雌性C57BL / 6小鼠用于这个协议。有两性之间白蛋白漏出无显著差异。

1.盐酸准备

1. 使56.2毫盐酸_无菌加入1N盐酸281微升至4.72毫升的无菌生理盐水（SNS）。滴定至pH值为1.25用1N盐酸（≈0 - 50μL）。
2. 使这个准备新鲜之前受伤。由于低pH SNS是不是缓冲它保证了盐酸伤害侮辱是短暂的。

2.麻醉气管曝光技术

注意:确保受伤过程与麻醉气体清除木炭过滤通风橱内进行。的无菌条件保养是必要的，因为这是一个生存手术。使用无菌手套和消毒的玻璃珠手术器械消毒所有仪器手术对每个动物之前。利用窗帘来隔离手术部位的建议保持无菌。使用异氟醚作为麻醉气体，因为它提供一个相对低的血液气体溶解度允许麻醉快速诱导，以及损伤后迅速恢复。

1. 通过与在以2升/分钟的流速氧2.75％的异氟醚的室诱导麻醉开始。
2. 一旦老鼠被麻醉充分（不响应脚趾捏强大到足以不会破坏皮肤或引起深部组织损伤），暂停用1-0编织丝线缝合15厘米长的门牙优越鼠标在60仰卧位^Ø倾斜的夹层板。
3. 确保麻醉是通过鼻锥递送异氟烷在整个手术保持。对小鼠的眼睛适用兽医药膏，以防止干燥。
4. 用电动修剪剃颈部的腹侧部分和应用局部消毒剂溶液（ 即 ，聚维酮碘）。用纱布去除多余的防腐剂，让干燥（约15 - 30秒）。
5. 渗透颈部从胸骨切迹到颚的劣部分与100μL的0.5％布比卡因中线（以提供预，围，和手术后止痛）。
6. 做一个1 - 用手术刀或弯曲精剪颈部1.5厘米纵向正中切口。有2个弯曲的锯齿状钳穿透钝性分离唾液腺之间的筋膜膜，露出气管（由白色软骨环标识）。
7. 依然采用了2锯齿钳，把握气管旁肌肉的一侧，它拉边，而亩之间解剖第一百纤维气管纵向下一步。
8. 一旦切割平面的建立，继续缩回气管旁肌肉作为第二钳子是气管下工作。使用这些镊子1-0编织丝线缝合的15厘米的链放置到钳子的前端与拉通过放置气管背后的缝合。

3.气管内滴入程序

1. 通过填写附着到22克针用0.2毫升的空气的0.5毫升的注射器接着3.6毫升/公斤的盐酸制备损伤滴注注射器。空气将充当在车辆的分散，以及一个肺泡复张，以帮助对麻醉给药期间可能经历肺不张的肺泡。
   注:按照有关手术后镇痛当地IACUC的指导方针，并与当地兽医咨询。请小心使用任何止痛药与雇用前抗发炎的特性ING无菌肺损伤的这种模式。
2. 要管理受伤，第一停止异氟醚管理。让鼠标的麻醉深度上涨约10 - 15秒，直到它开始镊脚趾捏反应。
3. 立即开始伤害滴注步骤。如果麻醉深度太深动物不会损伤滴注，这是含有盐酸损伤尤其如此后自发呼吸。
4. 有一个助理挤压胸腔驱逐肺活量。
5. 使用1-0编织丝线缝合围绕气管以前放置的优用它拉来牵引，然后将注射器针头插入1 ^和第 2 ^次喉软骨下方环之间气管。针斜面应面对医生和推进，直到斜面是刚刚过去的针与气管尽可能平行气管。
6. 只是单次给药前释放胸部盐酸以保证分散和沉积到远端气道和肺泡。存款丸大致0.5 - 0.75秒。保持针在气管直到第一自发呼吸取为保证整个损伤丸药体积被吸入到肺部。
7. 关闭切口使用是1 - 2皮肤钉或缝线。

4.恢复

1. 用5毫升注射器用＆G针，注射1毫升SNS皮下脖子颈背液体复苏。虽然过程中最小的液体流失，手术后的鼠标往往不喝酒，并有可能脱水。可替代地， 通过腹膜内注射提供的SNS。
2. 在加热腔鼠标放置在37℃灌注100％O _2。确保鼠标被放回外壳之前充分的恢复。监测动物在此期间，直到门诊和充分R请勿不闻不问ecovered。

5.支气管肺泡灌洗和肺处理

1. 诱发和按步骤2.1中所述维持异氟醚麻醉和步骤2.2。确认使用步骤2.2中所述脚趾捏法麻醉足够平面。
2. 固定在解剖板仰卧位置并使用钩在优越门齿1-0编织丝线缝合的一个循环来延伸颈部。对眼睛应用兽医药膏，以防止干燥。
3. 去除颈部皮肤钉后，请通过从下腹壁皮肤正中纵形切口，通过前面的颈部切开用剪刀下颌骨。
4. 使用剪刀腹腔肌肉正中切口，并收回与海绵腹腔脏器暴露腹膜后间隙。如果需要的血液，收集此时腹主动脉或下腔静脉。
5. 由横断abdom通过安乐死放血的动物INAL主动脉和下腔静脉。通过利用在下面的步骤双边开胸安乐死的二次验证方法，通过IACUC准则，将建立以人道完成。
6. 穿孔隔膜造成肺萎陷。然后使用骨骼切割剪刀切掉膜片，并通过笼平行肋切割和胸骨的两侧。使用的锁定止血缩回胸骨襟翼以方便注射5毫升温暖（37℃）的Hank平衡盐与钙和镁溶液进入右心室冲洗肺脉管。
   1. 作为得到从主动脉血液之前本文中描述的方法评估周边细胞因子水平，使得在左心室的小切口，以提供必要的流出血液离开循环到足够冲洗肺脉管系统如果不能获得血。
7. 道具夹层板60°倾斜，并使用日E工作步骤步骤描述2.2，以方便插入20国祥½"不锈钢在气管插管，安全的以1-0缝线。
8. 水平放置的夹层板，并进行支气管肺泡灌洗（BAL）。
   1. 要执行BAL连接两个5毫升注射器到3路阀。填写一个针筒5毫升的SNS，然后拧入活塞的端口。安装一个空的5毫升注射器到^第二端口，最后附上活塞的开放端口放置在步骤5.6气管内插管。灌输1毫升生理盐水到肺和灌洗第二注射器。
   2. 重复5总共1毫升生理盐水灌注小心了气管插管保持安全且平行于气管，因此它不会撕裂气管。
9. 用于组织学分析，导管插入气管如步骤5.7。通过在20 _cm H2O的，用10％中性福尔马林缓冲液吹入24小时修复肺。
10. 删除每个肺叶carefully用剪刀和镊子由横断支气管肺门附近。在组织学盒各肺叶（共5个）将被石蜡包埋之前。切割5微米组织切片用切片机，并用苏木精和曙红使用标准组织学技术染色。 ⁶形态特征也可以在组织学载玻片进行量化的严重性炎症。 ⁴
11. 通过在4℃以1500 xg离心离心3分钟处理回收的BAL。分装在等效量的无细胞BAL上清液到2.0毫升离心管以供将来分析。存储在-80℃。
12. 分析通过ELISA白蛋白浓度，或感兴趣的任何其它生物产品的BAL。 ¹¹从BAL的沉淀的细胞进行计数，生成cytoslide标本，并与基于赖特-吉姆萨染色对白血球分类计数测定来评估肺'染色炎症反应。

酸吸入性肺炎的小鼠模型的肺组织病理

如上所述，并取出肺24小时后的低pH侮辱，切片，H＆E染色（ 图1）小鼠受伤。坏死细胞，肺实质结构，细胞和碎片空域内和显著PMN浸润的损失被清楚地观察到。类似于临床心愿，我们在产生斑片状浸润中性粒细胞和纤维蛋白蛋白沉积的区域远端肺空气空间的异质性损伤模型的结果。这非常类似于人类ARDS患者观察组织学的模式。

白蛋白漏出到航空公司

酸吸入的特点是血清蛋白进入气道的泄漏。该SEV此病原响应于低pH肺泡损伤的erity通过测定BAL白蛋白浓度测定。 BAL中白蛋白浓度增加相比在2小时生理盐水（NS）控制和5小时（ 图2）以下的酸吸入。这是与在患者中观察到下列酸吸入的病理生理学相一致。被选中的时间点为中性粒细胞浸润发生2小时后酸吸入和最大的非致命性肺损伤发生在5小时后酸吸入。

图 1: 以下盐酸吸入CD-1小鼠24小时肺组织病理学。 H＆E染色，从小鼠未受伤（A和B），并用盐酸受伤鼠标5微米的部分（C - H）。坏死细胞（箭头），罗实质结构，细胞和碎片内的空域（箭头）和显著中性粒细胞浸润（*）的SS被视为整个从损伤小鼠肺部。异构分布远端肺有斑片状中性粒细胞浸润和纤维蛋白蛋白沉积的区域观察到。这非常类似于ARDS的病人的组织病理学。比例尺= A和C = 2毫米; B，D，F = 200微米; E = 100微米;和G和H = 60微米。在A和C方框指示分别放大图像中的B和D，区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:白蛋白漏出到航空公司下列酸吸入。无细胞BAL液fr的白蛋白浓度OM C57BL在2小时和5小时后酸吸入/ 6小鼠。酸吸入了比较使用配对t检验5小时吸生理盐水对照组（n = 9）。误差棒表示SEM。 * = P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

其目的是通过胃酸的愿望是非常类似于酸肺炎和急性呼吸窘迫综合征后续开发过程中发生在人类的病理生理发展的ALI动物模型。在开发的模型，我们选择了提供高吞吐量数据采集动物物种，由于其低成本，短生殖周期，并用大量的调查工具（ 即 ，单克隆抗体，转基因的菌株）一个很好的理解免疫系统。

ALI继人类尖刻地损害肺泡上皮细胞和血管内皮屏障功能产生血清蛋白的漏出胃酸愿望。 BAL白蛋白已经被证明是肺通透性的敏感标记物作为其尺寸比其它血清蛋白小。此外，白蛋白可以以各种从比色测定以特异性ELISA测定法的方式进行评估。 ^{7 -}外部参照"> 9

支气管肺泡灌洗在临床设置用于检测肺损伤如血浆蛋白和炎症标记物都存在于健康的肺的肺泡空间内最小量。升高的BAL血浆蛋白表示内皮屏障功能的丧失。 ¹⁰

为了阐明胃酸抽吸的病理生理学，开发和其局限性的范围内表征的动物模型是重要的。限定模仿抽吸事件具有最大急性非致命的肺损伤相关的病症（ 即 ，pH值，和抽吸的体积施用），应减少在这样的胃抽吸/急性肺损伤模型中固有的可变性。在小鼠最大非致命性肺损伤的3.6毫升/公斤pH值1.25盐酸，模拟胃酸的愿望后发生。 ¹¹胃酸的愿望改变肺泡液体清除肺部独立的血流量或血管过滤。胃酸抽吸/ ALI损伤¹²的组织病理学特征与中性粒细胞炎症的片状区域，肺泡出血，肺泡内和间质水肿的急性炎症反应。为了提高盐酸造成伤害肺泡的最大数目的分散性，人们应该发起之前滴入强制呼气。这有利于分散到远端空域，并产生最大的肺损伤的肺泡。这呼气动作是由胸部和释放后滴注的圆周压缩生产。这是经过验证的技术的在大鼠模型中递送的腺病毒对大鼠即表现出了绿色荧光蛋白（的Ad-CMV-MNLS-HSV1sr39tk-EGFP）的分散体到远端空域肺部，从而提供损伤车辆到预期的修改版本网站（ 例如 ，肺泡）。 ¹³

我们用5毫升生理盐水总数达到灌洗1毫升增量肺部。虽然小鼠的正常薄层为1毫升用的大容积确保的恢复为了量化损伤白蛋白的最大金额。考虑到这会冲淡蛋白质和更使促炎介质，因为它们通常是在皮克/毫升的在正常情况下的顺序是重要的。变性可以通过BAL液的一致处理来减轻。利用这种方法时，利用假手术对照组动物应以作出适当的比较，因为本身产生炎症的气管切开术进行。

另一种方法向小鼠提供足够的麻醉是通过氯胺酮和甲苯噻嗪腹腔注射相比，异氟醚作为本文描述。这个选项最好留给根据执行此替代方法，其舒适程度的研究员。优点包括作为麻醉药是众所周知的改变正常的免疫系统的生理免疫反应最小化的互动。

疗法Ë已经在小鼠中使用气管插管的方法，这需要进一步调查可靠地再现人类ALI的病理许多进展。与插管技术存在的问题包括:适当的气管导管放置超越线和隆突以上;喉痉挛和支气管痉挛;喉外伤的技术本身造成的。这些正在使用，该方法采用了开放气管方法消除。这种方法也不是没有局限性然而作为气管切开本身产生与注射针进行可能进一步增加严重受伤的危险损伤和酸滴注。从小鼠此过程中的疼痛，随后的恶化围手术期血容量减少继发缺乏饮用水的清醒。因此，该方法提供了一种插管技术，如果正确地进行，可减少损伤的量的替代方案。

总之，这种动物模型采用一种开放tracheostOMY盐酸滴入模拟胃酸的愿望进一步ALI人体病理生理学的理解，ARDS的后续发展。随着人类的生理机制是独一无二的，没有单一的动物模型再现ALI的所有特征。但是，如果此ALI小鼠模型或任何动物模型的特性的模型的限制和范围内解释，产生的数据可以提供在人类肺损伤响应的键元件的聚焦测试。研究者必须克服共同至ALI的所有型号的限制和使用一个最适合于检验他们的假设，并认识到对所使用的模型和人类之间的差异。 ⁹

The authors have no competing financial interests to disclose.

Ravi Alluri and Hilliard L. Kutscher are supported by Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (NRSA) Institutional Research Training Grant 1T32GM099607.