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我们描述了一个协议,以监控使用前体切片准备小鼠视网膜锥感光细胞的轴突终末钙离子动力。该协议允许锥钙离子信号的一个重要哺乳动物模型系统全面的研究,鼠标。
视网膜光感受器锥(锥)担任日光视野,并歧视色彩的基础。他们受变性,往往导致失明,在许多视网膜疾病。钙(Ca 2+),在感光体信令和代谢的关键的第二信使,已经提出了被间接地与光感受器变性在各种动物模型相联系。系统的学习生理学锥的这些方面和病理生理学已经阻碍了从这些小细胞在视网膜由视杆细胞为主的鼠标电记录,特别的困难。为了避免这个问题,我们使用表达上述基因编码的钙生物传感器的TN-XL只在锥和可与小鼠模型为光感受器变性可杂交的转基因小鼠系建立了双光子钙成像协议。这里描述的方案涉及制备垂直部分(R20;切片小鼠和锥钙水平光刺激诱 发的变化光学成像视网膜")。该协议还允许"在片测量"绝对的钙离子浓度;作为录音可被随后的校准。这个协议使研究成功能性锥体性能和预期有助于锥体的Ca的理解2+信令以及钙离子的光感受器的死亡和视网膜变性的潜在参与。
视力开始光致活化的视网膜感光的光转导级联。视杆细胞允许在视力低光照水平,而锥感光细胞介导的色彩和高分辨率的视觉白天。许多感光体特异性基因易受突变导致这些细胞的变性。若干与感光体损失相关的分子标记物已被鉴定1,但迄今的详细的分子机制和事件的序列仍不清楚。改变的Ca 2+动态平衡被推测是光感受器细胞死亡的一个触发器,以Ca的活性2+依赖性蛋白酶型蛋白酶的变性过程2,3中上调支持的假说。然而,到目前为止,这种假设不被钙离子的生理测量支持。对钙通道阻滞剂在重效应在一些研究中的不一致tinal疾病进一步挑战钙在细胞死亡4-6的参与,呼吁方法在哺乳动物锥感光细胞直接评估的Ca 2+。
以前,大多数电子记录和钙成像研究已经因为在对视锥细胞的7-9更容易获得两栖爬行动物模型的表现。然而,哺乳动物感光生理学可能与非哺乳动物的10和尤其是不同,在人的遗传性视网膜变性的范围内,更好地了解哺乳动物感光生理学的是一个关键的新颖治疗方法的发展。许多小鼠模型模仿人类视网膜疾病也有,但很少有人知道钙动力学在小鼠锥11。电技术不适合用于从锥体高通量的录音,尤其不小鼠,其中杆(〜97%)显 著多于锥(〜3%)12 。此外,如全细胞膜片钳记录敏感电生理技术扰乱细胞内环境,并提供关于绝对细胞内Ca 2+浓度对Ca 2+电流的数据,但并非如此。因此,尽管在较低的时间分辨率,成像是选择的方法解决对锥体的Ca 2+动力学问题时。与成像的关键问题是如何有选择地与荧光钙指示剂染料标记的视锥细胞。适当的条块和细胞特异性是很难实现的"批量装入"合成的Ca 2+指示剂染料进入组织。作为结果,标记的锥体,杆13,14,和米勒胶质细胞不能可靠地区分。另外,合成染料趋于渗漏出细胞,从而防止一致的条件下延长的录音。此外,在他们的AM-酯形式装载合成的Ca 2+的指标是有问题的,因为它需要去tergents( 如 DMSO)中,并生成甲醛15。对于绝对的Ca 2+测量,比率指标是强制性的。然而,最好的目前可用的合成比率指示剂Fura-2需要在700〜760纳米范围内的激发光(对于双光子激发),这取决于它的强度,可以在本身刺激视锥细胞,并且因此阻碍研究锥钙的生理光照条件下的动态2+。
不像合成染料,遗传编码的Ca 2+指标可以表示在一个细胞类型选择性方式。它们不漏细胞出来,因此,如果避免漂白,长时间和可靠的比例测量是可能的。细胞类型选择性的钙离子的生物传感器的表达,当与双光子显微镜组合,表示一个强大的工具下基本上生理条件13,16,17,以评估和研究亚细胞的Ca 2+ 。在这里,我们描述了一个协议,以研究光刺激诱 发锥钙在转基因钙的生物传感器鼠标线2+动力学(HR2.1:TN-XL),它体现了基于FRET的钙传感器TN-XL 18选择性地锥,在人红视蛋白启动子HR2.1 19。要访问锥端,一个离体切片准备20被雇用。该协议已经成功地运用在锥功能三个研究健康小鼠10,21,22。此外,该协议允许研究锥钙离子在特定的遗传条件, 如信号,通过杂交小鼠模型的遗传性视网膜变性HR2.1:TN-XL小鼠。
所有动物的程序进行遵守的准则和法律对动物保护由德国联邦政府决定,并经图宾根大学的体制动物福利委员会。
1.动物模型
2.视网膜解剖
3.双光子钙成像
通过组合垂直切片( 图1)从HR2.1制备:TN-XL小鼠视网膜与双光子成像( 图2),我们能够进行在锥光感受器轴突终末的光刺激诱 发的Ca 2+信号比例测量。这种方法是在访问和以上合成的Ca 2+指标预先存在的光学成像方法可视化小鼠锥体一个显著改善。例如,该基因编码的比例的Ca的圆锥特异性表达2+生物传感器的TN-XL大大便利锥轴突终端的识别(参见感兴趣区中图3A)。因此,我们的协议消除了来源不明的记录信号的风险,例如"混合"的捐款来自锥和视杆轴突末端的信号。
我们的方法允许在INDIVI的水平解决审单的响应双锥轴突终末。的Ca 2+从锥形终端光诱发挤压带标记的增加及在供体和受体荧光,分别为( 图3B)的降低。降低荧光比(R)对应于钙 离子从锥形终端( 图3C),引起的锥体和电压门控的Ca 2+通道的随后关闭的光致超极化的挤压。因为几个锥形轴突终端可以同时监视( 图3A),数据采集是非常有效和数百锥体的Ca 2+响应可以被收集在一个单一实验。通过评估这些反应定量( 图4),锥的Ca 2+信号进行比较和在各种条件下的(见讨论)来评价。
它往往是足够用FRET的受体(柠檬色)和端供体(ECFP)荧光之间的比(F A / F D;有关详细信息,请参见3.4)作为细胞内钙离子水平的相对度量。然而,在必要时,其比例是可以校准,以获得绝对细胞内Ca 2+浓度([Ca2 +浓度)( 图5)。在这个协议中使用的背景照明(详见10和图3的传说),校准产生一个估计的绝对休息的[Ca 2+]在"野生型"HR2.1:TN-XL鼠标锥端243±159纳米(平均值±标准差),这是报告的小鼠在文献11的范围内。
图1.准备的垂直切片视网膜。 (A)孤立和被压扁的视网膜准备切片。(B)一块长方形的视网膜(See值在一个红色框)切片后安装在滤纸膜(深灰色)。(C)的膜-安装的视网膜切片固定在使用润滑脂的玻璃盖玻片的顶视图。(D)一种视网膜切片的一部分的示意图(见C红色框)。锥光感受器显示为绿色。五,腹; D,背; N,鼻; T,时间; OS,外段; ONL,外核层; OPL,外网状层; INL,内核层; IPL,内网层;保利协鑫,神经节细胞层。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.双光子视网膜切片成像:插图记录配置 上:水浸泡物镜聚焦的是点扫描激光(红色向下箭头)到视网膜,并收集发射的荧光(向上箭头)。该透镜还收集透射红外光从照明LED使用CCD照相机成像的切片时安装在冷凝器下方中心 :视网膜切片安装在记录室中,并灌流细胞外溶液底部 :聚光用透镜聚焦的光由刺激发光二极管(与用于CCD相机成像的红外LED)通过记录室的透明底部进入视网膜组织。红外灯,红外发光二极管;的CCD,电荷耦合器件; BP,带通。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.光呼魂ð 钙在小鼠锥感光细胞轴突终末反应。 (A) 左图:录音集中在光感受器锥体(绿色)的视网膜切片突触终端(红色框) 右:例一记录区域的7个人终端。使用两个信道的荧光被记录:(535 BP 50上)和一个用于FRET的供体ECFP(底部; 480 BP 32)一个用于FRET的受体黄水晶(B)的光诱发的变化柠檬色(F A)和ECFP(F D)荧光记录在一个单一的投资回报率。(C) 钙离子反应(如比F A / F D)圆锥终端的一系列1秒耀眼的光芒在闪烁5秒间隔。投资回报率,感兴趣区域; BP,带通滤波器;男,荧光强度; AU,任意单位; FRET,福斯特共振能量转移; ECFP,增强青色荧光蛋白。刺激强度(如对HOTO异构化率在10 3·P·-1每锥):13.0和12.8 M和S-视蛋白,分别加入到背景水平(=指示灯熄灭,激发激光〜10扫描) 请点击这里查看该图的放大版本。
光诱发锥钙离子的响应图4.典型的定量分析(一)光诱发的Ca 2+从单一的终端锥反应(如ΔR)(单独审判:灰色痕迹,N = 16;平均: 黑色痕迹)(B)的参数确定的平均值的Ca 2+响应:静息钙水平(R 基本 )表示前光刺激的基线,响应大小作为芳EA-下的曲线(R A)和峰值幅度(R 放大器 ),响应发病动力学(叔上升 ,从20%至80%R 放大器的时间间隔)和偏移(叔衰减 ,时间间隔从80%至R 安培的20%)。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.估计绝对Ca 2+浓度。静息钙离子浓度( 钙离子浓度 ,因为比F A / F D)记录在8锥轴突终末在TN-XL鼠标(圆圈,平均±SD)对于不同的胞外溶液:在标准外培养基两次(Ctrl键1和2),然后以最小的("零")的[Ca 2+](10毫米EGTA)的ð具有较高的钙离子浓度(2.5毫米),在5微米的存在霉素平衡细胞内外钙离子后两个条件。 请点击此处查看该图的放大版本。
使用电单细胞记录或Ca 2+成像用合成荧光指示剂预先存在的协议很难记录在小鼠锥感光细胞的钙离子动力学为一定数量的技术原因(见导言)。这里所描述的协议允许的Ca 2+信号,甚至绝对的Ca 2+水平的个体,确定鼠标锥体终端以有效和相对简单的方法测量。
该协议已经被成功地用于在三个研究在健康小鼠视网膜寻址锥体功能的不同方面。在第一项研究10,HR2.1:TN-XL小鼠用免疫组织化学,ERG录音,双光子钙成像和药理学特征,显示出钙离子的生物传感器的圆锥特异性表达不妨碍圆锥体解剖结构和功能。在第二项研究中21,色度和鼠标锥消色差响应性能进行了映射整个视网膜,展示了"绿色"视蛋白为主的背和"蓝色"视蛋白为主的腹小鼠视网膜之间的显着差异,锥的功能。在锥体属性这些区域差别匹配在自然环境中的微分对比度分布( 即,天空与地面),这表明不同光谱类型的鼠标锥体提供消色差对比(近)最优采样的,因此,可以提供一进化优势。在第三项研究22的往复反馈锥轴突终端接收从水平细胞进行了研究。由于所有提出的水平细胞反馈机制上的电压门控的Ca 2+通道的锥形轴突末端28充当,锥形终端的Ca 2+可以作为水平细胞-锥体相互作用的代理。由KEMMLER和研究同事22支撑认为水平细胞使用,包括多种机制来控制光感受器谷氨酸释放一个复杂的反馈系统。
这些研究说明了所描述的协议的通用性,并表明,它可适应很宽范围的关于锥体功能和它的突触电路的问题。此外,该协议使学习当地的钙信号在不同的车厢锥,对更好地理解锥生理学。这种知识是重要的是理解在退化锥病理生理过程,以最终允许对潜在的治疗方法的合理开发,特别是用于影响锥退行性疾病。
在HR2.1:TN-XL鼠标线, 钙生物传感器被表示整个锥体,除所述外段的。这为钙离子的动态直接和比例的评估机会S在不同的车厢锥。由于改变的Ca 2+电流的外段都反映在通过膜电位和产生的电压-门控的Ca 2+通道的活化端子,在所述外段的过程可以间接观察到。
潜在的隐患:
视网膜剥离是一个关键的一步:在小鼠,视网膜从眼罩通常光感受器外段和色素上皮之间的分离。因此,分离的视网膜的光敏感的感光外段暴露和机械损伤极其敏感。极大必须小心不通过触摸感光侧与工具或通过侧向移动所述组织上的粘合面( 例如,一个过滤膜)的损害。
高品质的视网膜切片在显微镜下,他们的清洁切割面识别和由一个组织严密的感光层有明确界定外节。切片质量功能评估可以通过闪烁明亮的光线刺激和响应确定的视锥细胞的百分比( - 20锥例如,在视图10场)迅速完成。这里,响应质量应通过计算信噪比(S / N)(基线噪声的光刺激与光响应的振幅之前振幅)进行评估;一个S / 2 N - 3,应考虑的最低阈值。通常情况下,我们丢弃片,用小于50%的响应锥体。还切片与显示过度的自发扣球行为(参见图4中的10)应该被丢弃锥体。
符合上述解剖和功能标准录音室片显示1相一致的响应- 2小时(有关响应一致性的详细信息,请参见10)。由于片生存用于h我们在保持室,一个成功的实验可长达6小时。值得注意的是,有关于学习锥和水平细胞之间的长范围的空间相互作用的一些限制,如切片不可避免切断视网膜网络横向连接。然而,视网膜片的厚度增加至300微米的可改善这一问题22。
利用垂直视网膜切片由激发激光避免扫描感光锥体外段,因此,在很大程度上可以防止视蛋白漂白(对于广泛的讨论,见10,21)。然而,所记录的Ca 2+信号不仅取决于光刺激,而且还得到受由扫描激发激光产生的背景照明组件。事实上,在这样的双光子成像实验的有效背景照明是散射激光,荧光灯由记录策发射的组合LLS,以及任何LED背景刺激成分。因此,圆筒应允许适应至少20 - 30秒到激光扫描(与光刺激的背景成分接通)记录之前。
优势和应用:
虽然一些应用这种锥钙 -imaging协议上面已经描述了10,21,22,其他应用程序可以设想:在锥钙成像相结合药理研究可以确认的Ca 2+锥信号传导通路,可能是用于测试的疗效和钙中针对不同玩家的药物药性2+ -信号10。然而,一个关键的应用可以是研究影响锥功能疾病。许多视网膜变性小鼠模型模仿人类的疾病都可用。例如,锥光感受器损失1(CPFL 1)小鼠是伯锥体变性模型痛苦从PDE6C突变29。相反,该杆变性1(RD 1)小鼠遭受一个PDE6B突变。虽然这会导致初级视杆变性30,一次次 1杆损耗完毕,二次锥变性套1。杂交这些动物用HR2.1:TN-XL线将使学习和在初级和次级锥形变性比较钙动力学和可能在锥体细胞死亡提供有价值的见解的Ca 2+的作用。此外,药理学诱导锥变性-例如使用选择性抑制剂PDE6 -可能有助于查明锥变性10,29,31下游的机制。
综上所述,该协议描述这里允许在小鼠锥感光细胞亚细胞器测量的Ca 2+,并提出很好的机会来发现在广泛的生理锥生理和病理生理条件。此外,该协议可以用于旨在干扰锥体的Ca 2+ -信号,从而有助于建立锥体疾病的新疗法药剂的筛选。
作者什么都没有透露。
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany | Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
[header] | |||
XLUMPlanFL 20X/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |
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