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斑马鱼的发展可以遵循以上光片镜天,当胚胎嵌在光学透明的聚合物管与低浓度琼脂糖。
光薄片显微镜是理想的成像技术来研究斑马鱼胚胎发育。由于最小的光毒性和漂白,它特别适合用于长期延时成像在许多小时到几天。然而,适当的样品安装策略是必要的,同时提供隔离和样品的正常发育。多层安装,使用低浓度的琼脂糖在光学透明管一个新的嵌入技术,现在克服了这个限制,并释放出光片显微镜进行实时发育生物学的全部潜力。
理解胚胎发育过程中的复杂事件和相互作用,研究在发育生物学是越来越多地从单个细胞和器官的显微移动到体内成像整个生物体。传统显微镜技术通常不能提供的空间和时间分辨率以上的很长一段时间,以跟随快速的事件常常造成脱色或示例1中的光毒性效果。我们和其他人发现光片显微镜( 图1)是理想的技术在活体成像斑马鱼2-4。样品用薄板的激光的,正交的检测轴,该照明提供快速的光学切片的高空间分辨率,以及最小化的光毒性5。同时,由于这种独特的光学布置,使用的培养皿或培养腔室的传统样品的安装技术是不适合的。在一个典型的光片显微镜三个平移马达和旋转马达保持样本,以使得它可以被精确地定位,打开,并从任何方向看。在过去的标本进行光片显微镜常常被嵌入在1-2%琼脂糖玻璃毛细管6,7内。在这种情况下,与嵌入标本凝固的琼脂糖圆筒被挤压出来的玻璃毛细管进入充满水状介质用于成像的样品室。琼脂糖的折射率接近的水,因此是非常适合于在体内光片镜,有利于水校正照明和检测光学系统。样品被限制在刚性的琼脂糖和可成像很好的时间很短,但形态变化和胚胎的生长成像数小时7,8时被强烈地受到损害。虽然对于其它应用的解决方案已被开发如图9所示 ,非侵入性的长期的时间推移斑马鱼光片显微成像的潜力不能使用传统的1.5%琼脂糖包埋利用。
因此,我们开发了一个新的安装策略,斑马鱼胚胎10 在体内光片镜。样品被安装在0.1%琼脂糖有由光学透明的聚合物氟化乙烯丙烯(FEP)的管内200 mg / L的三卡因。嵌入式胚胎正常发展,由于介质的粘度低。在同一时间,该FEP管限制所述介质和样品在实验的持续时间。在这里,我们提供了新的安装技术和现在的数据反映其优于传统协议的详细协议。我们证明,我们的方法斑马鱼发育,可连续成像的高空间和时间分辨率在一段超过两天。
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图1:光片显微镜的原理。安装在制造氟化乙烯丙烯(FEP)的试管A斑马鱼可以翻译并通过检测目标的焦平面旋转。激光(光片)的一个薄片被照明的目标投射到检测目标的焦平面上并照亮试样的仅一个薄的光学部分。所发射的荧光信号被检测物镜收集并记录在摄像机芯片。
1。材料准备
2。多层安装
斑马鱼血管系统开发的多天成像
我们用1 DPF 的Tg(kdrl:GFP)13斑马鱼表现出与多层安装策略,长期光片显微镜的优点。其目的是对图像中的血管系统中的整个斑马鱼的发育超过2天的疗程。在斑马鱼胚胎中,安装在0.1%琼脂糖一个甲基纤维素包衣的聚合物管内。这里,斑马鱼未被安装介质的限制,并且可以正常地发育。它的头提出,尾部延伸和血管发芽不受阻碍地出现( 图3)。
图3。斑马鱼血管发育的多日的成像。一个multila的血管揭掉安装1 DPF 的Tg(kdrl:GFP)13斑马鱼的发展不受阻碍地在光薄片显微镜在两天的课程。 488 nm激光片光源激发的荧光,并使用10X/0.3 W的目标和EMCCD相机检测到信号。被收购的四个相邻的位置,每10分钟的Z-堆栈,随后缝合与斐济15。示的时间点的子集的最大强度投影。比例尺:500微米点击这里查看大图。
斑马鱼早期胚胎发育的成像
在这里,我们展示FEP管的能力,作为对斑马鱼早期胚胎发育过程中受精后的第一天灯片镜的安装支持。 8 HPF 的Tg(H2A:GFP)14斑马鱼胚胎被安装其完整绒毛膜一个E3填充管内与我新新人类创新直径为1毫米。而导致绒毛膜轻微夹紧。胚胎发育过程中所有的发育过程是不受安装并可以使用光片显微镜得到最佳可视化。在这个例子中,我们成像的样品在12小时的过程中( 图4)。在早期胚胎发育的典型形状的变化,如蛋黄,并沿中线组织增厚的增大伸长率,将使用不绒毛膜在1.5%琼脂糖传统安装时受到压迫。
图4的成像斑马鱼早期胚胎发育 的Tg(H2A:GFP)。通过早期胚胎发育14斑马鱼通过。 488 nm激光片光源激发GFP和荧光信号检测与10X/0.3 W的目标和EMCCD相机。 Z-堆栈从两个角度分别获得每3分钟超过12小时的课程。示的时间推移的一个子集的归一化最大强度投影。可见运动模糊在收购过程中胚胎抽搐19 HPF结果,因为没有麻醉剂被使用。比例尺:150微米点击这里查看大图。
如光片显微先进的显微技术,使我们在数天的过程中具有高时空分辨率来记录图像数据,还需要样品安装技术来提高。我们提出多层安装的斑马鱼发育的轻质板材镜的详细协议。该方法实现起来非常简单,我们用它在我们的实验室每天。
该FEP管
我们的安装策略的主要组成部分是由聚合物氟化乙烯丙烯(FEP)的管子。我们决定使用,主要是因为它的折射率1.338的指数,这是类似的水,因此非常适合用于光片用显微镜浸水的目标和要求含水介质样品FEP。用0.8毫米内径和0.4壁厚合适的显影斑马鱼非常良好的管,可以用适合于1.6毫米典型样品架被用来毛细血管,是我们对所提出的安装方法的第一选择。我们完全在我们的家庭建造的设置,也可以在商业系统“Lightsheet Z.1”卡尔蔡司显微镜测试了它们,结果发现全氟乙丙烯管提供长期稳定,对光学性能只有很小的影响,并有非荧光10。它们,然而,不适合于应用程序,需要一个不同的折射率, 例如 ,清除标本样品。
可在各种直径和厚度的管,以及全氟乙丙烯制成的箔。此外,FEP可在260℃熔化,从而提供了定制的样品安装支持几乎无限的可能性。聚合物管趋向于提供非无菌,这就是为什么在清洁协议包含几个步骤,以确保最佳的光学质量。用甲基纤维素的涂层确保了日益增长的斑马鱼胚胎的任何部分枝到聚合物中。
安装介质
0.1%琼脂糖的决定是基于增长速度,不动在不同浓度的琼脂糖和甲基纤维素10的广泛的测试。琼脂糖浓度0.1%以上,已经表现出对24 HPF斑马鱼的生长速度造成严重影响。此外,我们使用低剂量的麻醉药物三卡因的。三卡因块的动作电位,从而抑制大脑和肌肉之间的信号传输,并抑制肌肉收缩16。为133-200毫克/升的浓度,确保24-72 HPF斑马鱼之间有足够的固定化。然而,三卡因和其他麻醉药物,我们测试显示剂量依赖的副作用如心脏水肿。另外三卡因的所需剂量随胚胎的发育阶段。因此,我们建议降低三卡因浓度需要被成像的发展阶段的量。为了确保最佳performanCE和防止形成有毒的副产物,新鲜的或解冻三卡因原液使用,应避光和高于30°C加热不
在FEP管的嵌入还允许安装到中占据特定需求的容易变形。对心脏的时间推移成像,我们建议用3%甲基纤维素和100 mg / L的三卡因,而不是0.1%琼脂糖和200 mg / L的安装。甲基纤维素是高于0.1%的琼脂糖因而其本身提供了更高的固定性和少三卡因需要被使用,以确保胚胎的禁闭更粘稠。
三卡因是在温度高于30℃敏感,也可通过介质中的成像腔稀释,导致性能和胚胎可能抽搐下降。因此,请务必使用三卡因亦在其中安装的试样浸入成像介质。如果您的实验需要使用更高的温度下,我们要么经常通过使用灌注系统或手动用两个时间点之间的管和注射器建议在成像室交换的媒介。
关键步骤
样品的安装过程中的关键步骤是该试样的摄入量入管和琼脂糖插头的插入。吸气定义了胚胎的初始位置,这是麻烦的事后改变。多个标本应提供给安装和安装质量应用立体显微镜进行监测。如果样品取向不理想,改变拟定的标本,避免活塞的后续动作的速度可能会帮助,因为这往往扭曲的胚胎。在1.5%琼脂糖插头是必要的,以避免在0.1%琼脂糖的泄漏。管内的插塞的表面应是平坦的,以开发过程中不影响样品取向。为了达到良好的冲浪能手,不同厚度的琼脂糖层的需要进行测试和管需要被放入琼脂糖垂直于表面。旋转管一点点,拔出管子从盘仔细释放插头。的安装质量应与前成像立体显微镜进行检查。
多视点成像
光表镜的一个主要优点是多视点成像,旋转试样,从多个角度采集的z栈,并随后注册并融合他们的能力。已建立的方法来注册的Z堆叠在3D空间中是使用了样品周围作为受信标记17荧光珠基于珠子的登记。然而这种方法依赖一个牢固的安装介质,如1.5%琼脂糖,因而似乎是与此处多层安装呈现不兼容。但几种可供选择的解决方案根据不同的应用工作。首先,将荧光珠可以掺入琼脂糖插头,其具有将在视场的采集过程。第二,舞台的位置可以用与荧光珠1.5%琼脂糖柱的实际实验之前进行校准。第三,替代标记物,如荧光细胞核,可用于识别的Z堆叠的相对于彼此的位置。
蒸发
典型光片镜设置使用一个开放的样品室,这必然导致介质的蒸发。由于介质是必不可少的试样的生存,以限制所述安装介质的蒸发和对光学元件和样品之间的正确的折射率时,建议采取以下一种措施,以防止蒸发或更多。首先,在腔室中的介质,可以不断地通过灌注系统进行交换。第二,该介质可以被手动重新填充。第三,该腔室可盖上盖子或柔性箔。
氧气供应该聚合物的FEP的开发是为了承受大的各种化学品,因此是健壮的,化学惰性和不渗透到气体。在多层安装氧气的情况下只能通过琼脂糖塞和琼脂糖 - 空气界面渗透,但它仍有待证明如果比较时安装在1.5%琼脂糖无支撑聚合物管中的氧供给多层安装是严重降低。然而,由于安装在1.5%琼脂糖只能用约两小时之前斑马鱼的形态受到影响多层安装似乎是长期成像的整体优越的解决方案。
成像早期发展阶段
现在多层安装已经成为我们对斑马鱼的年龄超过24 HPF时间推移光片镜检标准的嵌入技术。除此之外,我们还可以使用聚合物管早期胚胎成像。电子mbryos留在他们的绒毛膜和被安装在一个FEP管1毫米的内径和充满E3。斑马鱼可以自由发展绒毛膜内,利用光片镜以及仍然可以成像。
展望
所提出的多层样品安装释放出的光薄片显微镜与斑马鱼实时发育生物学的全部潜力。它可以很容易地用于诸如光学投影层析成像(OPT)和其他微生物等显微技术所采用。我们认为,标准尺寸的全氟乙丙烯管只是对根据特定需求的样品安装技术的第一步。
作者什么都没有透露。
我们感谢马普学会,人类前沿科学计划(HFSP)和勃林格殷格翰全宗的资助和支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available |
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
1 M NaOH | |||
0.5 M NaOH | |||
70% EtOH | |||
Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 mm x 16 mm |
Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
10X/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |
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