快速比色测定RNA和DNA生物分子样品进行定性区分

甲套件迅速判别蛋白质，RNA，DNA，并重新引入糖在潜在的异质性的生物分子样品的比色测定法进行说明。

生化实验通常需要准确的知识，在早期阶段，所述的核酸，蛋白质，和其他生物分子的组成部分，在潜在的异构试样。核酸可以被检测到，通过几个既定的方法，包括分析方法，有分光光度法（ 例如 ，A _260），荧光（ 例如 ，荧光染料的结合），或比色（核苷，具体的显色化学反应的^）。1虽然它可以不容易区分RNA从DNA，A ₂₆₀ / A ₂₈₀比值是常用的，因为它提供了一个简单，快速的^评估 ，核酸的相对含量，主要吸收近260 nm和蛋白质，主要吸收280纳米附近的。视为指示“纯粹的”蛋白标本比率<0.8，而纯化的核酸，其特征在于，（NA）的比率> 1.5 ^3。

何wever，有场景，其中的蛋白质/ NA含量不能明确或可靠的推断，从简单的紫外 - 可见分光光度法测量。例如，（ⅰ）样品可能包含一个或多个蛋白质，这是相对缺乏负责吸收≈280nm处（色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）的芳族氨基酸，是与一些小的RNA结合蛋白的情况下，并（二）样品可以表现出中间A ₂₆₀ / A ₂₈₀比值（0.8〜1.5），其中的蛋白质/ NA含量远远不太清楚，甚至可能反映了一些高亲和力的蛋白和NA之间的关联。在这样的情况下，我们描述了一套比色法快速区分RNA，DNA和还原糖的一个潜在的混合样品的生物分子。该方法依赖本笃十六世戊糖和其他碳水化合物不同的敏感度，BIAL（地衣酚），Dische（二苯胺）试剂;流线型的协议可以是COM处理完成，在短短的几分钟内，没有任何额外的步骤隔离组件。该试验可以被并行地执行，来区分的RNA和DNA，以及指示免费的还原糖，如葡萄糖，果糖，核糖（ 图1）的存在下。

许多细胞生物学发生通过涉及DNA和RNA的分子间的相互作用^。4这些天然存在的核酸（NAS）彼此互动^，5与蛋白质，第⁶和在体内与主机的小分子化合物和配位体（ 例如 ，二价阳离子^7）。的相互作用可能是短期或长期的（动力学），范围从高至中度到低亲和力的（热力学实力），而且也表现在化学性质上的巨大变化和特异性-某些团体是很特别的（ 例如 ，DNA· ··转录因子，RNA···剪接因子），而其他的相互作用是必然远比更通用的（ 例如 ，DNA···细菌组蛋白样胡蛋白质^8）。可以有非特异性相互作用与定居在体外实验中，涉及的混合物biomo实际后果lecules，因为它是可能的，甚至是有可能的，一些定居将与感兴趣的生物分子的关联，至少在所使用的实验条件下的一些子集（离子强度，溶液pH值， 等 ）。

考虑，例如， 通过异源表达的重组蛋白在大肠杆菌中的细胞培养生产的一种蛋白质（POI）的感兴趣的，在几乎任何结构生物学实验室，这样的程序进行例行⁹在进一步的实验中准备的，例如生物化学/生物物理特性，结晶， 等 ，最初的努力一般都集中于获得足够数量的POI作为尽可能纯的一种形式，理想状态为化学均质和生物物理单分散的试样。破坏的宿主细胞后，一个典型的纯化工作流程的早期阶段的目标是隔离的POI从大肠杆菌大肠杆菌的蛋白质，核酸，细胞壁碎片，和其他部件的细胞溶胞产物。但是，主机NAS合作净化的POI数理化的原因-一个非常基本的POI非特异性下拉宿主DNA / RNA的POI可能有一个通用的NA-约束力的活动（ 例如 ，上述HU）;该POI可能是一个相当具体的NA-结合蛋白，但表现出与宿主的RNA或DNA的交叉反应性，主机定居可能交互用色谱基质，从而简单地与POI共洗脱;及等等。不分青红皂白，高亲和性结合的主机来港定居的POI，可以构成一个棘手的问题，，因为NA杂质可能会影响下游实验（ 如荧光的各向异性实验的POI•RNA结合^10）。或者，未预料到的POI的···NA协会也可以被看作偶然的，作为这种相互作用照亮​​的POI的核酸结合能力。无论哪种方式，是否定居是关键部件或污染物，一个必须首先量化和识别类型（DNA，RNA）的共同净化定居下游实验准备。

存在几种分析方法，用于检测和定量样品中定居。大多数可用的方法是从根本上无论是分光光度法（ 例如 ，A吸光度值₂₆₀和A ₂₆₀ / A _280的比率），荧光（ 例如 ，有约束力的噻唑橙或其他荧光染料NA），或色度（核苷化学反应的敏感性收率的发色团吸收的电磁波谱的UV-Vis区域），最近由De梅伊等人描述^。1然而，识别类型的多核苷酸的RNA或DNA的关键步骤是超出了范围，许多这些定量的方法。在这里，我们提供了一套比色测定法，以迅速确定的蛋白质样品中的NA组件的类型。

该协议描述这里c可以有效地执行而无需额外的步骤中分离的潜在NA杂质，和依靠Benedict的测定用于减少糖^11，地衣酚测定戊糖^12,13，和二苯基胺的反应^14,15的2'-deoxypentoses（ 图1和图2） 。的笃的测试（ 图2a）利用的能力的线性，开放-链（醛）形式的醛糖糖以减少铜^{2 +，}伴随氧化的糖的羰基，以一个羧酸酯基团和生产的Cu _{2 O的}作为不溶性沉淀。该反应将测试带免费还原糖，如醛糖和酮糖（转换到相应的醛糖通过 enediol中间体）阳性，但不与被锁定的共价骨干的DNA或RNA的多核苷酸的一部分成环状形式的戊糖。由于简约的半缩醛功能的要求，其他共同mpounds试验阳性在这个测定法- ，因此作为潜在的干扰物-包括α-羟基酮和短低聚糖（ 例如 ，二糖麦芽糖）。无论是BIAL地衣酚（ 图2b），是在初始破坏的多核苷酸骨干Dische的二苯胺（ 图2c）的反应， 通过脱嘌呤核苷和进一步的酸，或碱催化的水解的父核苷酸，使其呋喃-2甲醛（ 糠醛 ）衍生物，这些衍生物然后与多羟基酚，如地衣酚（BIAL）或二苯胺试剂形成彩色的缩合产物，很大程度上是未知的化学结构（Dische）。的DNA与RNA特异性Dische的检测源于一个事实，即与戊糖必须是2'-脱氧以易被氧化的ω-hydroxylevulinyl醛，其中，还与二苯胺反应在酸性条件下产生一个明亮的蓝色凝析（ 图2c）。使用这里描述的精简协议，我们已经发现这些糖特定的比色反应可以区分的RNA和DNA，并也将表明的免费的还原糖，如葡萄糖，果糖，或核糖的生物分子样品中的存在。

1。本笃十六世为还原糖的含量

1. 本笃十六世的试剂准备一个合适的数量 - 940毫米无水碳酸钠，588 mM柠檬酸钠脱水，68毫米铜（II）五水硫酸铜。这种试剂可以存储在室温（RT）为至少6个月，没有明显的反应性变化。
2. 上述试剂是6倍。因此，600μL的反应中，加入100μl本笃十六世试剂一干净的1.5ml离心管（ 如 Eppendorf公司品牌），每个样品进行检测。
3. 加入任何地方从10微升至500微升的样品此管，在最初的试验运行，基于颜色形成的强度，可确定最佳的音量。如果有足够的采样，是可用的，那么开始进行这种试验在最大可能的样品的体积（ 即 ，六分之五的整体的反应体积，在这种情况下，将500μl的样品），然后在随后的测定稀释。
4. DDH _{2 O}涂是，使终体积为600微升;混合溶液通过涡旋或移液。
5. 在沸水浴中20分钟，孵育样品。
6. 从浴中取出加热样品，并让它冷却10分钟，在RT。
7. 离心样品管在> 9,300 xg离心（10,000 rpm下在一个FA45-24-11的Eppendorf固定角转子）为5分钟，以沉积物任何颗粒材料;此步骤中更重要的是定量而非定性研究。
8. 等分试样的上清液从该管到一个干净的比色皿中。
9. 空白，紫外可见分光光度计水。
10. 该样品在475 nm处测定吸光度。

2。 BIAL的地衣酚含量为戊糖

1. 准备一个合适的数量的新鲜BIAL试剂 - 24.2 mM的地衣酚一水合物（见该化合物的结构的图2b），6 M的HCl，0.025％w / v的氯化铁六水合物。 注：扩展存储的BIAL的试剂可以制备作为两个单独的库存的解决方案：（ⅰ）试剂A [0.05％w / v的氯化铁•6H _2ò在浓HCl]（ⅱ）试剂乙[422 mM的苔黑素一水合物制备在95 ％的乙醇。试剂A可以存​​储在RT六个月;试剂B可以在4℃下存储一个月，用箔片覆盖，以限制曝光。这些原液中的图15（A）：1（B）的体积/体积比在使用前混合。
2. 上述试剂是2x。因此，为1.0毫升的反应，添加500μl的BIAL试剂，洁净的1.5 ml离心管中，每个样品进行检测。
3. 加入任何地方从10微升至500微升的样品本管。至于每个音符的1.3（上述）中，如果有足够的采样，是可用的，那么开始试使用最大可能的样品的体积（ 即 ，一个一半的总的反应体积中，在这种情况下，将500μl的样品）的反应，并从那里稀释。
4. 加入DDH _{2 O}至管带来的final量为1.0 mL，涡旋式或移液混合溶液。
5. 在沸水浴中20分钟，孵育样品。
6. 从浴中取出加热样品，并让它冷却10分钟，在RT。
7. 离心样品管在> 9,300 xg离心（10,000 rpm下在一个FA45-24-11的Eppendorf固定角转子）为5分钟，以沉积物任何颗粒材料;此步骤中更重要的是定量而非定性研究。
8. 从这个管分装上清到一个干净的比色皿的目视检查。
9. 对于半定量分析，用空白的UV-Vis分光光度计与水，并测量在660nm处的吸光度的比色皿样品。

3。 Dische的苯胺含量2'-deoxypentose的糖

1. 准备Dische的二苯胺试剂- 60mM的二苯基胺，11 M冰醋酸酸，179 mM的硫酸，62％v / v乙醇的合适的数量。这种试剂可以预先相比提前在一个黑暗的容器内，储存在室温下或用铝箔纸覆盖，以限制光暴露。由于光灵敏度的试剂不能无限期地储存，但在实践中，它可以每天两至三个月没有明显的变化反应。
2. 上述试剂是2x。因此，为1.0毫升的反应，添加500μl的Dische试剂，洁净的1.5 ml离心管中，每个样品进行检测。
3. 加入任何地方从10微升至500微升的样品本管。至于每个音符的1.3（上述）中，如果有足够的采样，是可用的，那么开始试使用最大可能的样品的体积（ 即 ，一个一半的总的反应体积中，在这种情况下，将500μl的样品）的反应，并从那里稀释。
4. 加入DDH _{2 O}至管带来终体积为1.0毫升;，通过涡旋或移液混合溶液。
5. 在沸水浴中20分钟，孵育样品。
6. 取出加热样品的浴缸和异体瓦特它在室温冷却10分钟。
7. 离心样品管在> 9,300 xg离心（10,000 rpm下在一个FA45-24-11的Eppendorf固定角转子）为5分钟，以沉积物任何颗粒材料;此步骤中更重要的是定量而非定性研究。
8. 从这个管分装上清到一个干净的比色皿的目视检查。
9. 对于半定量分析，用空白的UV-Vis分光光度计与水，并测量在600nm处的吸光度的比色皿样品。

4。进一步的使用注意事项

1. 下面的类的分子化合物，每个检测为阳性和阴性对照反应是合适的参考：
   • 本笃十六世-正面的游离核糖，果糖，葡萄糖，负= RNA，DNA，ATP 等 。 （任何缺乏自由还原糖功能的糖类）
   • BIAL -正RNA（ 如面包酵母提取物），核糖，磷酸腺苷，UMP;负=牛SER这个白蛋白（BSA）或任何其他蛋白质
   • Dische -正= 如小牛胸腺DNA（）;负RNA，ATP 等 。 （任何非-2'-脱氧核苷酸）
2. 这些测定法已发现常常在蛋白质纯化中使用的化合物是相当的弹性，例如，常见的盐，如NaCl，（NH _4）2 SO _{4，K 2} SO ₄没有干扰，而出现的反应一般不受的稀释剂的内容。洗涤剂或离液序列高的剂如尿素可能会影响测定的反应性，如果pH值是高碱性;一个中性至酸性pH值范围是一般最优化的BIAL的和Dische的检测，因为在底层反应化学（见的文本和质子在图2b中，三 ）。潜在的不理想的反应条件下，怀疑是干扰物等 。应在逐案基础测试，使用阳性和阴性对照实验瓦特第i个参考化合物。

结果示于图3，用于应用这些已知的参考化合物的比色测 ​​定法。代表性的定性数据笃的：（a），BIAL的地衣酚（b）中和Dische的二苯胺（三）测定所示，这三个检测的标准曲线示于图4中 。在面板3（交流），左侧面板显示阳性/阴性对照实验中，使用适当的无功/不反应的分析物，这些可视化的结果示于原位 ，在所描述的比色皿，在协议中，1-3（以上）。右子板各自的分析显示滴定系列。在该笃的测定（一）中，阳性对照是核糖（0.42毫克/毫升），而阴性对照是水，一个通用的蛋白（0.75毫克/毫升BSA），和2的非还原性糖（DNA为0.75毫克/毫升和RNA在12.5毫克/毫升）。在地衣酚法（二），阳性对照组是核糖（0.15毫克/毫升），RNA（7.5毫克/毫升），和DNA（0.45毫克/毫升），而水和BSA蛋白（0.45毫克/毫升）的阴性对照。在二苯胺测定（三），小牛胸腺DNA（0.45毫克/毫升）示出作为阳性对照，和水，酵母提取物RNA（7.5毫克/毫升），核糖（0.15毫克/毫升），与BSA（0.45毫克/毫升）作为阴性对照。最后，面板（d）表示由示出的Dische的反应不同的异质性的样品：在左边的两个样品作为阳性对照，DNA + RNA的混合物（比色皿1-2）所示的两种浓度的DNA的检测方法的鲁棒性（在不同的比率）在接下来的三个样品（3-5）所示，最后的三个样品显示的DNA的情况下（样品6）或存在（样品7-8）的核酸结合蛋白“HFQ'。含¹⁶注Dische的检测的阳性结果保存DNA样品，即使在存在的“污染”RNA或蛋白质。

定量分析：在图3中的（交流）的稀释范围面板不同，因为每个反应具有一个独特的视觉检测的限制，这取决于被检测的糖的类型。光度法，而不是视觉，检测可以用来改善的测量范围内， 例如 ，如在图4中所示的（a）本笃的，（二）BIAL的，和（c）Dische的检测。虽然这里所描述的协议旨在作​​为主要定性测定，比尔 - 朗伯吸光度和浓度之间的关系，使至少半定量估计的糖或核酸含量。作为一个标准曲线校准的笃的试验的一个例子，一个线性回归拟合的吸光度（475纳米）对核糖浓度显示在图4（一），误差条表示标准偏差的n = 3重复的平方相关系数设置。偏离线性度非常低的核糖浓度（ 如 0.28毫米的数据）反映了此法的灵敏度有限。虽然作为说主要是用于定性研究进行半定量分析，下面的指南建议：

• 对于本笃的检测（ 图4a）：将反应读出（ _{波长475nm）}被认为是线性至少在范围0.04→0.5毫克/毫升的分析物，如，一式三份进行。
• 有关的BIAL的测定（ 图4b）：的吸光度数据（甲_660nm的 ）线性至少取值范围为0→0.5毫克/毫升的分析物（面包酵母的RNA），测定已被执行在一式三份（直径² = 0.99的线性回归系数）。虽然样品离心澄清吸光度测量之前，发现在这些低浓度的分析物没有沉淀剂，因此在离心步骤不是绝对必要的。分析偏离线性分析物的浓度超出此范围。
• 对于Dische的检测（ 图4c）：A组_600纳米 的反应被发现是直链的至少超过0.15→0.75毫克/毫升的分析物（小牛胸腺DNA）的范围内，已被测定（R ² = 0.99），一式三份进行。吸光度的情节对[分析物]在0.90毫克/毫升DNA开始高原，表示的线性响应区域的边界。
• 实际的考虑因素进行定量或半定量分析：除去沉淀的物质，否则将影响吸光度读数，所有三个实验需要离心合理的时间长度，最大速度（25,000的XG，或任何限制，可以承受的微量离心管） （ 例如 ，20分钟），这是特别重要的，在较高的分析物的浓度。离心后，澄清的样品可以被转移到一个小杯或微孔板（ 例如 ，96孔微量滴定板），方便的吸光度测量。

图1。决策树应用程序的检测。的生物分子（ 例如 ，从全 ​​细胞裂解物）具有潜在的异构样本开始，这里描述的比色测 ​​定法，可以使用，以确定是否该混合物含有非还原性糖（Benedict的试验）。如果是这样，那么BIAL的地衣酚试验进一步揭示的非还原性糖的人口是否包含戊糖环（如在DNA或RNA），与六碳糖（ 例如 ，葡萄糖，以及其他吡喃糖）和可能尚未其他的醛糖。最后，如​​果样品中含有至少一个温和的馏分的DNA然后2'-脱氧核糖环的反应与Dische的二苯胺试剂（酸化和加热后），产生了明显的蓝色的缩合产物。请注意，该图中是决策树，不是的流程图：示出的测定结果的逻辑serially，但检测可以并行执行的。

图2。相关的化学反应中示出的比色测定法，用可检测的有色产物旁边标明相应的反应。 （一）不溶性红色沉淀Cu _{2 O的}本笃十六世为还原糖的检测结果是积极的。 （b）在加热和酸化含戊糖环，糖分解成糠醛 ，然后与地衣酚（BIAL试剂），以产生一种可溶性的蓝绿色的加合物。在Dische的检测在2'位上的羟基的取代基，缺乏使开环的氧化反应，其中的醛产物进一步与二苯胺反应[（pH值_）2 NH〕以产生明亮的蓝色产物。化学ST为大的，多环的缩合产物的地衣酚（b）和二苯基胺（三）反应ructures仍然未知。

图3。参考化合物和异质样品的比色测 ​​定法中的应用。样品结果示本笃的（一），BIAL的（b）中和Dische的（三）比色测 ​​定法。在（a）→（C），左子板显示阳性/阴性对照，使用适当的反应/不反应的分析物和右子板，每个分析显示滴定系列。还示出的是一个说明性Dische面板的反应（d），其中被分析物中的异质性而异 - 任一DNA单独（左），DNA / RNA的不同的比率（中间）的混合物，或DNA在核酸 - 相关蛋白的存在下（ 'HFQ'）。这些面板代表性的成果“部分的文字中有进一步的描述。

图4。标准曲线，检测与参考化合物。本笃的校准曲线示出（a）中，BIAL的（b）中和Dische的（三）测定，为每个测定中示出有代表性的部分的线性响应区域。适合的线性回归，并相应的相关系数被表示为每个测定。标准的面包酵母RNA（B）与小牛胸腺DNA（三）在这些系列滴定分析物。 点击此处查看大图 。

比色法这里提供一个简单的方法来快速评估，如时遇到的纯化蛋白质，RNA或全细胞裂解物的复合物，准备进一步研究生物分子混合物的化学性质。结构生物学追求更自然的组件，逐步更大的挑战，如样本的异质性，将所构成的复杂和多组分复合物。超分子组装往往只有轻微稳定，他们的成功分离纯化条件可能要求不那么严格（ 例如 ，如发现剪接snRNP复合^17,18）。在这样的温和的条件正宗和杂散的POI···NA相互作用是更可能持续存在，从而干扰下游测定与靶蛋白或核酸。必要的第一步是识别在这些样品中的化学成分的类型。

这里所描述的协议抵抗，特别是在最困难的反应产物进行简单的目视检查，必须特别注意​​采取更多量化（分光光度法）分析。比如，在笃的检测中，在存在高浓度的核糖形成红色的沉淀剂（ppt）的必须分光光度分析之前除去，这是很容易实现通过离心。 Dische的检测，加入二苯胺试剂是伴随着通过形成的白色的ppt，可以通过加热溶解;一个绿色的PPT形式中DNA的存在可能会干扰用分光光度法测量，进行定量分析之前，必须拆除。此外，每个测定是基于化学反应，很容易受到潜在的干扰物，如引言中所述，进一步详情载于下文。最后，我们注意到，一个高的相对浓度的RNA在一个DNA / RNA混合物可以掩盖的预期的积极结果的Dische的分析，这个假阴性的DNA梗，一个高摩尔分数的RNA也反应， 通过糠醛中间体， Dische的试剂，但产生而不是蓝色的与的2'-deoxypentose的DNA糖的反应所产生的加合物为无色产品。

潜在的干扰物：除了显而易见的糖，脂肪和蛋白质的情况下，有两个其他的生物分子，可以假设这些比色法由于交叉反应（误报）或屏蔽反应（假阴性）造成麻烦。原则上，几种类型的细胞脂质可以想象干扰，包括glycosylglycerols和其他共轭甘油脂糖，鞘糖脂（ 例如 ，蜡brosides），糖脂（ 例如 ，葡糖胺衍生物），脂多糖，依此类推。在实践中，这些类脂类是不会构成问题，在工作与亲脂性蛋白，因为他们是比较少见的，与更丰富的磷脂，因此我们的实验在检测限以下。由于大多数蜂窝上述脂质而非戊糖己糖（半乳糖，葡萄糖）是建立在，它们不应该干扰作为在BIAL或Dische的检测的假阳性。可能会假阳性的的免费单糖，包括果糖呋喃半乳糖，或其他furanoses的的。与此相关的，不需要的糖的干扰可能会成为一个问题，表达的重组蛋白与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签。在亲和层析步骤的用于净化等的融合构建，麦芽糖用于洗脱的蛋白质，并在下游制剂残余麦芽糖可以想象的是，可能会干扰与日ë本笃的吸附法（它是最一般的/非特异性的检测;麦芽糖的葡萄糖单元不应该根据BIAL或Dische的反应）。因此，在后的色谱分离步骤，必须谨慎行事，以确保剩余的麦芽糖没有产生虚假的结果。我们没有测试糖化蛋白质或其他糖蛋白，但我们怀疑，这将是很难得到一个明确的阳性结果存在这种蛋白质的糖（或糖脂，多糖，糖复合物），因为我们期望的糖基我们的检测灵敏度极限之下。原则上，包含一个免费的己醛糖如葡萄糖的溶液，解放从一个葡糖基化蛋白通过酸水解，将测试的本笃的检测阳性;同样，源自一种糖蛋白，戊糖，如木糖，应得到一个阳性结果的BIAL的法。然而，在实践中，糖蛋白需要一个积极的结果非常Ĥ室内运动场的蛋白浓度，即使对于乘法糖基化的多肽​​，由于低的糖/蛋白质的摩尔比。

这里描述的检测方案可扩展，适用于处理小样本的限制- 即小卷或低浓度的分析物。对于有限的样本数量，我们已发现，该反应可以按比例缩小到100微升的范围（ 例如 ，使用的PCR管及热循环仪的温育步骤）。在低浓度下（接近检测极限），对于小体积的样品的板阅读器配备分光光度计可以使用，在这样的情况下，唯一的预期困难将吸光度测量之前去除任何不需要的沉淀剂。尽管简单的视觉检查的检测范围有限，此处描述的方法的一个优点是它的效率和快速，能够即刻加热时被分析的样品。

没有利益冲突的声明。

这项工作是由美国弗吉尼亚大学和Jeffress纪念信托基金（J-971）。我们感谢K. L.哥伦布，耆那教，P.兰多夫的有益讨论和批判性阅读的手稿。