局部应用药物研究烟碱型乙酰胆碱受体功能的小鼠脑片

在本文中，我们描述了一个有用的方法来研究神经元的急性分离的大脑切片配体门控离子通道的功能。这种方法涉及使用的药物填充微量移液器为本地应用程序使用标准的膜片钳技术记录神经元的药物。

烟草使用导致许多健康问题，包括癌症，心脏疾病，肺气肿和中风。吸烟成瘾是一种普遍的神经精神疾病，源于尼古丁对整个中枢神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）细胞生物物理和行动。理解不同胆碱受体亚型中存在的对尼古丁上瘾有关的脑区是一个重要的优先事项。

实验，采用如全细胞膜片钳或两电极电压钳记录的电生理技术是有用的药理特性的兴趣的nAChRs。细胞表达的nAChRs，如哺乳动物组织培养细胞或非洲爪蟾卵母细胞，在物理上隔离的，因此容易使用现代药理学工具研究。已经取得了很大的进展，特别是当使用这些技术的目标受体已知一个第二异位表达很容易实现。然而，通常情况下，有必要在他们的母语环境中学习的nAChRs：从实验室小鼠或大鼠急性收获大脑切片的神经元在。 ，例如，小鼠表达“过敏性”胆碱受体亚基如的α4L9'A小鼠¹和α6L9'S的小鼠^2，允许用于明确识别它们的功能表达的特定的胆碱受体亚单位的基础上的神经元。虽然全细胞膜片钳技术记录神经元在大脑切片的由熟练的电生理常规的做法，它是具有挑战性的局部应用药物，如乙酰胆碱或尼古丁的记录细胞内的脑切片。药物稀释成灌流（沐浴应用）是不可逆的迅速，和不容易适应U型管系统与大脑切片。

在本文中，我们描述了一种方法，迅速将胆碱受体激活的神经元的药物在成人米乌斯大脑切片。标准全细胞的记录，则在切片中的神经元，并填充与感兴趣的药物的第二微吸管被操纵到所记录的小区附近的位置。加压的空气或惰性填充药物的吸移管的入氮气的注入会导致少量药液要喷射到记录小区从移液管。胆碱受体介导的电流是使用这种方法，能够解决的问题与毫秒的精度。药物的应用时间可以很容易地被改变，和填充药物的吸移管可以缩回和替换一个新的移液管，使浓度 - 反应曲线，以创建为一个单一的神经元。虽然描述的胆碱受体神经生物学的上下文中，这种技术应该是有用的用于研究许多类型配体门控离子通道或受体的神经元从大脑切片。

1。溶液的制备脑片的制备及电

1. 先前描述解制备脑片^3，4。制备N-甲基D-葡糖胺（NMDG）-基切削和恢复解决方案下面的组合物（以mM计）：93 N-甲基D-葡糖胺，2.5氯化钾，1.2的NaH ₂ PO _4，30的NaHCO _3，20 HEPES，25葡萄糖，5 Na ^+的抗坏血酸盐，2硫脲，3的Na ⁺丙酮酸，10用MgSO _{4·7H 2 O，0.5}的CaCl _{2·2H 2 O。}调整为300-310毫渗NMDG。 10 N的盐酸调节pH值至7.3-7.4。
   1. 微孔水硫酸镁_{4•7H 2 O}和CaCl _{2·2H 2 O}溶解在2 M解决方案的每个股票。
   2. 称取其它组分按列出的顺序和使用Millipore水加至部分填充的容量瓶中，同时搅拌以溶解。一旦一切都被添加，填充使用Millipore水的容量瓶中。
   3. 测量pH值，并用10 N HCl调整。
   4. 测量的渗透压与NMDG必要时进行调节。
2. 准备HEPES保持人工脑脊液（人工脑脊液）下面的组合物（以mM计）：92的NaCl，2.5氯化钾，1.2的NaH ₂ PO ₄的NaHCO _3，30，20 HEPES，25葡萄糖，5 Na ^+的抗坏血酸，2硫脲，3钠⁺丙酮酸，2硫酸镁_{4•7H 2 O} 2的CaCl _{2·2H 2} O。调整到与蔗糖的300-310毫渗。用1N HCl或NaOH调节pH值至7.3-7.4。
   1. 称出组件中列出的顺序和使用Millipore水加至部分填充的容量瓶中，同时搅拌以溶解。一旦一切都被添加，填充容量瓶中，用Millipore水。
   2. 测量pH值，如果需要的话，用NaOH或HCl调节。
   3. 测量必要时与蔗糖的渗透压和调整。
3. 准备标准的人工脑脊液记录下面的组合物的溶液（以mM计）：124的NaCl，2.5氯化钾，1.2的NaH ₂ PO _4，24的NaHCO _3，12.5葡萄糖，2用MgSO _{4·7H 2} O，2个的CaCl _{2·2H 2} O。调整到与蔗糖的300-310毫渗。用1N HCl或NaOH调节pH值至7.3-7.4。

2。急性脑片的制备

1. 脑切片的切割和恢复完成后，如先前描述的^3，4。气泡2晶体菜肴填充与NMDG回收溶液与95％氧/ 5％CO ₂气体（Carbogen增），在冰上的一盘，在33℃下
2. 气泡一个晶体培养皿填充用HEPES与Carbogen增在室温下保持人工脑脊液。
3. 麻醉与Na ⁺戊巴比妥钠（200毫克/千克，IP）的成年小鼠（年龄2个月至12个月）。继续进行到脚趾，捏动物有没有反应的过程。
4. 如果有必要，切尾的组织样本后genotypING的动物。
5. 打开胸腔，暴露心脏，夹住降主动脉。割伤右心房。
6. Transcardially灌注动物用5-10毫升0-4°C NMDG恢复解决方案。
7. 斩首动物，取出大脑，并将其放置在4℃NMDG回收溶液，持续1分钟。
8. 在冰 - 冷却的金属板，在所需的取向（冠状，矢状窦，水平等）修剪大脑包括感兴趣的区域。
9. 词缀大脑块与强力胶的干燥阶段表面振动的限幅器（DSK-零1;土坂），大脑块浸入4℃下NMDG回收溶液，并不断泡沫溶液与Carbogen增。
10. 切割片的大脑区域的利益。切片厚度为200-400微米，取决于特定的大脑的感兴趣区域，动物的年龄，和实验以进行。
11. 切割后，立即孵育所需的片在carbogenated的，33°C NMDG恢复的解决方案整整12分钟，然后转移到carbogenated，室温HEPES最初的60分钟内解决方案。这孵育60分钟后，切片可用于记录。片被保持，直到它们被用于记录整个一天保持溶液在HEPES。

3。膜片钳记录神经元在大脑切片

1. 拉一个标准的补丁微量移液器与一个可编程的火焰山 - 布朗拉出器（萨特P-97或等效垂直拉拔器）。千兆欧姆形成密封的最佳选择移液器，通常有4-6MΩ的电阻
2. 一个片传输到记录室（RC-27L;华纳仪器）上的一个直立显微镜（尼康FN-1）阶段。连续superfuse（1.5 - 2.0毫升/分钟）的切片与carbogenated，标准记录人工脑脊液加热并保持在32℃下另外，切片可以被保持在室温下。
3. 兴趣使用的大脑区域的定位和中心10倍的空中目标（尼康计划福陆公司的10倍，NA 0.3，WD：16毫米）。
4. 可视化单个神经元，使用40倍的近红外（IR）的水浸泡目标（尼康APO 40XW; NA：0.80; WD：3.5毫米）连接到红外微分干涉对比（DIC）的光学和近红外的一个高速电荷耦合器件（CCD）摄像机（滨松C-7500）。在IR-DIC观察，健康的神经细胞呈现出光滑，浅灰色的质膜。
5. 填写微量合适的细胞内记录解决方案。对于大多数的应用中，我们使用下面的解决方案（以mM计）：135葡糖酸钾，5 EGTA，0.5的CaCl _2，2的MgCl _2，10 HEPES，2 Mg的ATP，和0.1 GTP（调节pH至7.25，Tris碱，渗透压调整至290毫渗用蔗糖）。建立一个可视化的神经元的全细胞记录。

4。药物局部应用神经元片

1. 拉动上述标准的膜片钳微吸管。运用如萨特P-97，产生两个相同的“姐姐”的提示，在同一块玻璃移液管牵引是有利的，当在同一单元中要使用多种药物的解决方案。提示的大小，如果他们被填充有上述的细胞内的解决方案，将有一个电阻〜5MΩ都是最优的。
2. 回填的微量吸移管在carbogenated，标准记录脑脊液稀释药物的溶液。尖端指向向下，挥药物填充微量移液器被困在列的解决方案，以消除任何气泡。
3. 挂载填充药物的微量吸移管与管连接到一个合适的压力喷射系统，例如作为一个Picospritzer III（一般阀门有限公司）中的吸液管保持。吸管架应安装在相同的分辨率显微操作机械手常用的膜片钳记录（例如，萨特MP-285）。此外，操纵器应该允许斜向运动的流入和流出的切片。曼ually喷射到微管中的压力的​​3至4倍，以建立的列后面的流体的足够的压力。
4. 使用微操作机器人控制，降低药物的吸液管片，而IR-DIC光学可视化的提示下。理想情况下，一个应该可视地识别和中心的神经元被记录，随后定位药物吸移管附近的细胞之前降低记录微吸管到切片。定位药物吸移管可以在周边所记录的细胞，可能会破坏的记录，如果药物移液管移入位置后建立gigaohm密封引起的组织的运动。
5. 使用IR视频，定位药物微量吸移管的顶面处的组织切片。执行一个压力喷射和显示器1）的前端附近的运动有关喷射的碎片，和2）的微量吸移管前端的尖端被堵塞或阻塞的任何迹象。如果笔尖被封锁/堵塞，收回pipette和它与一个新的更换。
6. 接近记录的单元格从斜切片的顶部这样的，在最终位置时，填充药物的吸移管的前端是1）在相同的焦平面（或稍低于）作为记录的细胞和在记录电极的前端，和2）从所记录的小区10至40微米。如果药物填充的移液管尖的是上面的记录单元的力从压力喷射可能扰乱gigaohm的的密封。
7. 钳位电压模式或电流钳模式中的单元格，记录所需的细胞免疫应答。我们经常在记录乙酰胆碱和/或尼古丁引起的细胞电流，同时在电压钳模式下的神经元。虽然压力喷射可以手动触发使用Picospritzer III时，更具有可重复性的结果，最好是使用的采集系统（轴突Digidata 1440和膜片钳pClamp 10.3）与数字TTL脉冲触发的压力喷射。

5。控制药物填充微管与一个压电翻译

1. 如果可能的话，装载的药物填充的吸液管保持到单维压电翻译（ 例如 Piezojena PA-100或伯利PZM-150），其能够接受一个模拟电压输入（再次，从采集系统），这是然后安装在高精密显微操作器（的萨特MP-285）。一种压电转换器是非常有用的，流入和流出的薄片，包括入口/出口的时间和速度，因为运动的药物填充移液器可以更容易地控制和再现从实验的实验。在研究的nAChRs，脱敏尼古丁泄漏的影响，从填充药物的吸移管，他们应该发生，被最小化的吸移管时只移动靠近细胞具有压电翻译的压力喷射的时刻。
2. 使用电位器手动控制，的压电电压控制放大器，请拨打电压到其最大值。
3. 使用显微操纵器，位置在切片的药物填充吸管移液管将退出其内容上录制的细胞，以及收回移液管通过手动的电压降低到零上的压电电压控制放大器。
4. 使用从记录采集系统的模拟输出信号，将药物填充吸管到切片中超过250毫秒300毫秒开始的压力喷射TTL脉冲发生之前的期间。退移液管超过250毫秒的一段时间，起始TTL脉冲结束后的50毫秒。

在我们的实验中，我们经常记录多巴胺（DA）神经元的腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNC）。在电压钳模式下，压力应用乙酰胆碱或尼古丁这些细胞通常会导致在一个快速，向内阳离子电流到达100-200毫秒（ 图1A-B）内的峰。通过扩散作用部位的药物从很大程度上取决于电流衰减，在该切片中的酶是否是本代谢成无活性形式的药物。例如，乙酰胆碱是位于细胞表面的脑区DA神经元^5，有丰富的乙酰胆碱酯酶迅速水解。这将导致诱发的电流（ 图1A）中的迅速衰减。与此相反，尼古丁是不水解和尼古丁的诱发电流不衰减迅速ACh激发性电流（ 图1B），这使得它能够强烈ACTIV吃了脱敏nAChRs ^6。

压力喷射系统允许操作者改变的压力脉冲的时间。此功能是有用的，因为它允许在研究大脑切片内的表面上的神经元的nAChRs研究者确定药物的脉冲响应的最大诱发电流是否已经取得了。例如，在图2所示的痕迹药物的应用，250毫秒（灰色线）可能会或可能不会透露一个明确的最大诱发的电流，而1000毫秒药物的应用（黑线）产生一个明确的最大电流，再加上一些稳定国家脱敏。解决这样的“峰”电流是至关重要的，当构造一个准确的浓度 - 反应曲线，或当研究胆碱受体脱敏。

在腹侧中脑多巴胺神经元往往引发自发性动作电位记录在急性脑片^7，8。 α6L9的老鼠，前按下的nAChRs响应强烈的10〜100倍的浓度较低的尼古丁或乙酰胆碱^2，9-11，表现出增加的运动响应尼古丁注射。关联神经元的活动与行为（动作电位射击），它是有用的尼古丁α6L9的DA神经元在电流钳模式下记录的。通常情况下，本地应用程序的尼古丁（1μM）至α6L9'S DA神经元将导致在一个快速和瞬态加速发射衰减30-40秒^2（ 图3中 ，上面板）内回到基线。这种对尼古丁的反应是很容易量化的（ 图3，下图）与相应的分析软件（ 例如膜片钳pClamp;分子设备公司）。

实验在培养的细胞或异位表达的nAChRs的非洲爪蟾卵母细胞中，可以享受一系列药物浓度的优点是，可以应用到每个记录单元^12。在脑片的神经元内，通常的浓度-反应曲线是不可能的，和一个单一的药物浓度的反应经常报道^1。然而，如本文中所描述的，药物填充移液器可以重复改变，以允许要施加到相同的记录单元在脑切片^{2，8，13，14之内的}多个浓度的药物。 图4示出了有代表性的数据从一个单记录的DA神经元，用三种不同浓度的乙酰胆碱刺激。研究者的经验，保持药物填充移液器具有非常稳定的微操纵器相结合，导致这种类型的实验中获得成功的关键因素。如果成功的话，这种方法提供了宝贵的药物有关本机的nAChRs的信息。

神经元在大脑切片，其中包括未知的细胞类型或人口的异构在场的人的脑部区域，通常分为使用的各种基本元素ctrophysiological和/或形态学的措施^15。例如，表达_我当前，静息膜电位，自发放电率，和单元格大小，是用来描述DA神经元^{2，7，8，16，17的}典型措施。使用我们的方法，但也可以基于其响应于本地应用尼古丁或乙酰胆碱^18，19来表征神经元。例如，上丘（SC）是具有极高表达各种的nAChRs，包括那些包含α6亚基²⁰异构的和相对未知的脑区。在α6L9的小鼠的大脑切片中，我们从几个SC神经元和尼古丁（1μM），一个充满尼古丁吸液管采用压力喷射记录。观察两种不同的反应类型：1）激活抑制性突触后电流（iPS细胞）（ 图5，I型反应），2）大外来阳离子电流与一些inducti对兴奋性突触后电流（EPSCs）（ 图5，II型反应）。

的压电转换器的使用提供填充药物的吸移管可以被保持在一个固定的位置，至少为100微米的距离的记录小区快速移动，直到它被相邻的单元格的压力喷射的优点。这是非常有用的，因为可以自动吸管运动，并从细胞到细胞和日常是一致的。它也是有用的，高浓度的尼古丁（这脱敏nAChRs）的时，被施加到记录的小区，因为它的影响减至最小的尼古丁泄漏从药物填充移液器应否发生。为了证明胆碱受体电流的一致性，在使用压电翻译时，我们记录了从腹侧被盖区多巴胺神经元在大脑切片从α6L9的老鼠。 图6显示了连续的响应，在同一α6L9的VTA DA神经元浓度的正icotine强烈激活过敏反应α6*的nAChRs（1μM的： 图6A; 10μM： 图6B）。如果允许连续泄漏到记录单元，这些浓度的尼古丁会预期脱敏的nAChRs在细胞表面上，和第2响应将是衰减相对于第一响应。

图1。代表胆碱受体的反应在DA神经元。在WT小鼠脑切片甲多巴胺神经元是电压钳位的ACh（100μM）的本地应用程序，然后通过压力喷射（250毫秒）使用的第二药物填充移液器。比例尺：100 pA的，3秒，B。实验A 中所述进行，不同的烟碱（100μM）被施加到的多巴胺神经元。比例尺：60 PA，3秒。

图2。解决的峰值电流通过改变药物的应用时间。在WT小鼠脑组织切片的DA神经元电压钳位，其次是乙酰胆碱的本地应用程序（100μM）。两个反应所显示的相同记录的细胞，乙酰胆碱的药物填充的吸液管被逐出250毫秒（灰线）或1000毫秒（黑迹线）。比例尺：50 PA。

图3。学习动作电位发射后，局部药物应用。在一个α6L9的小鼠大脑切片的DA神经元在电流钳（I = 0）模式，并自发动作电位，观察记录。尼古丁（1μM）施加使用压力喷射（250毫秒），和动作电位的发射率和静息膜电位的变化为观察到。使用pClamp软件（阈值的搜索），瞬时射速推导，并在下部面板上示出。

图4。多个药物的应用，以相同的记录的单元格。在电压钳模式下记录的DA神经元在一个α6L9的小鼠的大脑切片。一个充满药物的移液管用于本地应用乙酰胆碱（1μM; 250毫秒）。同时继续记录从细胞，药物填充移液器从切片被撤回和替换填充用3μM乙酰胆碱与另一吸管。甲至3μM乙酰胆碱的反应被记录，并且该过程再次重复为10μM的乙酰胆碱。比例尺：100 pA的，1.5秒。

图5。神经元胆碱受体的反应类型的分类。A组的上丘（SC）在α6L9的小鼠的大脑切片神经元电压钳位，其次是本地应用程序的尼古丁（1μM）通过压力喷射。 I型神经元表现出增加iPSCs的尼古丁应用。 II型神经元对尼古丁的应用呈现出巨大的内向电流和增加兴奋性突触后电流。比例尺：20 pA的，3秒。

图6。压电翻译提供的一致性和防止药物渗漏。一个VTA DA神经元的脑切片从α6L9的鼠标在电压钳模式下记录在应用1μM尼古丁的。充满尼古丁吸液管被操纵的压力喷射到最终位置之前，收回弹出后使用压电转换。第二个响应录得2分钟后，网络连接RST，以表明没有胆碱受体脱敏发生。比例尺：100 pA的，8秒，B。 在 A胆碱受体在α6L9的腹侧被盖区多巴胺神经元的反应，但，10μM尼古丁。比例尺：100 pA的，持续8秒。

本文提出的方法具有广泛的可用于研究配体门控离子通道的功能在大脑切片的准备工作。但是，也有若干因素，这将显着影响的实验数据，利用此方法的结果的质量和可重复性。例如，诱发电流填充药物的吸移管的前端的直径是非常敏感的。小tips将导致喷射药液，并具有低电阻的大秘诀将更有可能扰乱gigaohm记录的小区和记录电极之间的密封困难。提出的方法的另外一个限制是，在10微米的记录小区内的细胞，可能会接触到药物从填充药物的移液管，这可能会增加它们的活性，并且可能会影响记录的小区。

当施加药物多次的小区具有相同的药物移液器，至关重要的是，吸移管被返回到精确的相同的位置，在该切片中的每个应用程序。即使是很小的偏差（ 如 1-2微米），从一个到下一个位置，往往会导致很大差异，所观察到的峰值响应。一个可编程的压电转换器（如上所述）或机器人显微操作器用于定位的药物移液管是有利的。另一个重要的考虑是切片的记录细胞内的深度。药物往往会扩散开从一个细胞的表面上的切片更迅速，而药物可以被“困”时，喷射到位于切片内的深处的小区内的切片。这通常是一个重要的考虑因素时，尼古丁，容易麻痹的nAChRs时，曝光时间超过100-200毫秒。类似地，压力（psi）时，被喷射到的药物填充的移液管和施加压力的（ 图2）的时间量是重要的考虑因素，用于解释胆碱受体电流达TA。我们经常使用10-12 psi的压力，我们发现，250毫秒足够的时间来解决，而不会造成广泛的受体脱敏胆碱受体的峰值电流。

我们所描述的方法的一个重要优点是交换药物填充的移液管，使多个的药物浓度，可以应用到相同的神经元的提示的能力。交换时，吸液管的主要考虑因素是：1）移液器吸头从一个集中的位置到下一个，和2）变异移液器吸头直径的变化。一个高分辨率的近红外摄像机和一个精确的微操纵器，通常可以被充分控制的移液管尖的位置。在移液管尖直径的变异可以通过“姐姐移液器”只要有可能，并且通过使用具有高度的准确性和一致性的微量吸移管牵拉拉控制。

总体而言，本文中所描述的药物填充移液管法是一个非常有用的方法，当studyi急性脑切片中发现的神经元中表达，吴原生的nAChRs。除了被用于研究对尼古丁的依赖的神经生物学和烟碱样胆碱生物学，这种方法是很容易适用于其他的配体门控离子通道。 5-HT ₃受体_，GABA A受体和甘氨酸受体几个其他“半胱氨酸环”的受体，可以使用这些技术²¹研究。

这项工作是由美国国立卫生研究院（NIH）的资助DA030396支持。感谢成员的Drenan实验室的有益讨论和批评的稿件。特别感谢糜然金的技术援助和乔纳森·托马斯婷的意见，对成年小鼠的大脑切片。