تحليل شامل للصفائح الدموية المخثرة التي تظهر سمات النخر وموت الخلايا المبرمج وتنشيط الصفائح الدموية

يركز بحثنا على فهم استقلاب الصفائح الدموية والإشارات أثناء حالات التخثر ، مثل متلازمة الفوسفولبيد والسرطان ، بهدف تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة والأهداف العلاجية. كانت مجموعتنا في طليعة الزيادة الأخيرة في الاهتمام بكيفية مساهمة عملية التمثيل الغذائي للصفائح الدموية في تنشيط الصفائح الدموية وتجلط الدم. لا يزال التوصيف الدقيق لحالة تنشيط الصفائح الدموية في الدورة الدموية للمرضى لتحديد خطر تجلط الدم وكذلك الفعالية العلاجية للعوامل المضادة للصفيحات يمثل تحديا كبيرا.

تم الكشف عن تحلل السكر الهوائي ، ومسار فوسفات البنتوز ، وأكسدة بيتا للأحماض الدهنية باعتبارها مسارات التمثيل الغذائي للطاقة المميزة في الصفائح الدموية وتم تحديد إمكاناتها للاستهداف العلاجي. يعمل هذا البروتوكول على المساعدة في تحديد التوصيف الوظيفي الدقيق للصفائح الدموية المخثرة ، والتي تتميز عن الصفائح الدموية التجمعية ، وكذلك الصفائح الدموية التي تتعرض لموت الخلايا بسبب موت الخلايا المبرمج أو النخر. للبدء ، قم بتكملة الصفائح الدموية البشرية المغسولة ب 2.5 مللي مولار من الكالسيوم عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم 0.5 مولار إلى 100 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية.

حافظ على جزء واحد من الصفائح الدموية غير محفز وحفز الجزء المتبقي بمزيج من الثرومبين والمتشنج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التحفيز ، أضف ميكرولتر واحد لكل من الملحق V ، وحزمة واحدة ، والجسم المضاد المضاد ل CD62P إلى 100 ميكرولتر من معلقات الصفائح الدموية المحفزة. احتضن الصفائح الدموية في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو من 2٪ فورمالين قبل تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد كمية الصفائح الدموية المخثرة. لتحضير الصفائح الدموية ، قم بتخفيف الصفائح الدموية البشرية المغسولة بتركيز مليون صفيحة لكل مليلتر واستكمالها ب 2.5 مللي مولار من الكالسيوم. قم بتسمية الصفائح الدموية بخمسة ميكرومولار ROD2 للكشف عن الكالسيوم في الميتوكوندريا واحتضانها لمدة 30 دقيقة في الظلام.

لتحضير الصفائح الدموية لمقايسة تنشيط الكاسباز ، بعد استكمال الصفائح الدموية بالكالسيوم وتحفيز جزء ، أضف قالب وضع العلامات على الكاسباز النشط إلى معلقات الصفائح الدموية المحفزة. احتضن الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد 30 دقيقة ، قم بإصلاح الصفائح الدموية عن طريق إضافة حجم متساو من 2٪ فورمالين قبل تحليل الصفائح الدموية عن طريق قياس التدفق الخلوي.

تظهر النتائج أن الثرومبين تسبب في زيادة تعتمد على الجرعة في نسبة الصفائح الدموية التي تعبر عن كل من الفوسفاتيديل سيرين و P-selectin. تسبب تحفيز الثرومبين أيضا في زيادة تعتمد على الوقت في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا في الصفائح الدموية. ومع ذلك ، أدى تحفيز الثرومبين إلى تقليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الصفائح الدموية.

تحفيز الثرومبين ينشط كاسباز 8 ولكن ليس كاسباز 3 أو 7 في الصفائح الدموية.