هذا البروتوكول مخصص لطريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة يمكن استخدامها لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية المتعلقة بوظيفة ودور الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في الصحة والمرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج طبقة خلوية تمثل تمثيلا جيدا لطبقة الخلايا الطلائية البشرية ، بما في ذلك إنتاج المخاط والنشاط الهدبي. هذه التقنية متعددة الاستخدامات ويمكن استخدامها لدراسة الإهانات أو العلاجات المرتبطة بالمرض.
للبدء ، شطف حلقة الشعب الهوائية المعزولة من أنسجة الرئة البشرية مع 10 ملليلتر من PBS معقمة في طبق بتري 10 سم. أثناء إمساك الحلقة بملاقط ، استخدم مقصا صغيرا لإزالة أي نسيج ضام زائد وبقايا دم. قطع الحلقة إلى قسمين ، واغمر نصفين في 10 ملليلتر من محلول Protease 14 المسخن مسبقا في HBSS الذي يحتوي على Primocin في حاوية معقمة مغلقة.
احتضان قطع حلقة الشعب الهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، انقل القطع إلى طبق بتري يحتوي على 10 مل من PBS الدافئ ، وباستخدام ملاقط منحنية ، اكشط الجزء الداخلي من الحلقة للحصول على محلول خلوي. تجاهل الخاتم.
انقل محلول الخلية إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر ، وأضف برنامج تلفزيوني دافئ للحصول على حجم نهائي قدره 50 ملليلتر. قم بطرد محلول الخلية ، واستنشق المادة الطافية قبل إعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني دافئ. قم بتكوين الحجم إلى 50 ملليلتر باستخدام PBS ، وكرر الطرد المركزي.
أعد تعليق الحبيبات في KSFM الكامل الدافئ الذي يحتوي على بريموسين. بعد ذلك ، استبدل محلول الطلاء من اللوحة المكونة من ستة آبار بملليلتر من تعليق الخلية لكل بئر. اسمح للخلايا بالنمو حتى يتم الوصول إلى التقاء 80 إلى 90٪ ، من أجل الحفظ بالتبريد ل PBECs ، قم باستنشاق الوسط من الآبار واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ملليلتر من PBS الدافئ لكل بئر.
التربسين الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من التربسين الطري لكل بئر ، واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بتدوير محلول التربسين ، وحرر الخلايا عن طريق النقر برفق على اللوحة. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يحتوي على مثبط التربسين لفول الصويا.
قم بطرد التعليق ، وتخلص من المادة الطافية قبل إعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من KSFM تحتوي على البنسلين والستربتومايسين. بعد عد الخلايا على عداد خلية آلي ، أعد تعليق الخلايا إلى تركيز 400،000 خلية لكل ملليلتر في وسط تجميد ، وأضف ملليلتر واحد من هذا التعليق في cryovial. انقل القوارير إلى وعاء خلية باردة ، وضعها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.
بعد 24 ساعة ، انقل القوارير إلى 196 درجة مئوية تحت الصفر من النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. لطلاء قارورة زراعة الخلايا T75 ، أضف 10 ملليلتر من محلول الطلاء في PBS ، وأغلق الغطاء بإحكام قبل وضع القارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل محلول الطلاء من القارورة ب 10 ملليلتر من KSFM الكامل.
اترك الوسط يسخن إلى 37 درجة مئوية في الحاضنة بغطاء مفتوح قليلا للسماح للحاضنة بالدخول. قم بإذابة PBECs المحفوظة بالتبريد بسرعة في حمام حبة 37 درجة مئوية. أضف المحتوى بالكامل إلى cryovial إلى قارورة T75 التي تم تسخينها مسبقا وقم بتوزيع الخلايا بالتساوي.
بعد التأكد من ربط الخلايا بإحكام ، استبدل الوسط ب 10 ملليلتر من KSFM الكامل الطازج والدافئ ، وقم بزراعتها حتى يتم الوصول إلى التقاء 80 إلى 90٪. يتم إدراج زراعة خلايا المعطف بإضافة 400 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل ملحق ، واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية. التربسين PBECs في القارورة عن طريق إضافة ملليلتر من التربسين لينة ، واحتضان لمدة خمس إلى 10 دقائق.
قم بتسهيل انفصال الخلايا عن طريق الدوران والنقر برفق على القارورة. بعد ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من مثبطات التربسين فول الصويا إلى القارورة ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 25 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي التعليق وإعادة تعليق بيليه في ستة ملليلتر من وسط BD الكامل.
عد الخلايا على عداد خلايا تلقائي. بعد الطلاء ، قم بإزالة محلول الطلاء من الإدراجات. تمييع تعليق الخلية مع وسط BD كامل تستكمل مع نانومول واحد EC 23 وإضافة 500 ميكرولتر على الجزء العلوي من غشاء الإدراجات.
أضف 1.5 ملليلتر من وسط BD الكامل إلى البئر أسفل الملحق. عندما تكون الخلايا جاهزة للنقل إلى واجهة الهواء والسائل ، أو ALI ، قم بإزالة الوسط من الإدخالات والبئر ، وأضف وسط BD كاملا جديدا مكملا ب 50 نانومولار EC 23 فقط إلى البئر. تغيير الوسط في الآبار ثلاث مرات في الأسبوع.
لإزالة المخاط الزائد والحطام الخلوي ، أضف برفق 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني دافئ على الجانب القمي لطبقة الخلية داخل الإدخال ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، نضح برنامج تلفزيوني يحتوي على المخاط الزائد والحطام الخلوي. تم قياس TEER لتقييم جودة ثقافات ALI PBEC.
في سبعة أيام ، تعتبر المقاومة الكهربائية لطبقة الخلية أعلى من 300 أوم ثقافة ناجحة. علاوة على ذلك ، انخفض التباين بين المانحين في المقاومة الكهربائية بمرور الوقت بين اليوم السابع واليوم 14 من الثقافة في واجهة الهواء والسائل ، ويتأثر بشكل ملحوظ بأصل DMEM المستخدم. تمت ملاحظة جميع أنواع الخلايا الرئيسية المختلفة ، مثل الخلايا القاعدية ، والمهدبة ، والكأس ، وخلايا النادي ، بعد 14 يوما من ثقافة ALI ، وكانت مستويات التعبير تعتمد على المانحين.
من بين التركيزات المختلفة لاختبار EC 23 ، لوحظ الحد الأقصى TEER عند 50 نانومولار. تؤكد مقارنة حمض الريتينويك ونظيره الاصطناعي ، EC 23 ، أن التعبير الجيني لعلامات الخلايا المهدبة والكأس كان مشابها بين 50 نانومولار EC 23 وحمض الريتينويك. أدى استخدام وسيط من موردين مختلفين إلى اختلافات كبيرة في التركيب الخلوي ، في حين كانت الاختلافات في TEER أقل وضوحا.
من ناحية أخرى ، لم يؤد استخدام إدخالات من موردين مختلفين إلى اختلافات كبيرة في التحلل الخلوي. علاوة على ذلك ، لوحظ أيضا اختلاف في قيم TEER والتركيب الخلوي ل ALI PBEC ووسط PneumaCult مقارنة بوسط BD الكامل. عندما تكون الخلايا جاهزة للنقل إلى ALI ، قم بزيادة تركيزات EC 23.
أيضا ، لا تقم بطرد الخلايا بعد ذوبان الجليد ، وقم بإزالة الخلايا بسرعة من بلاستيك زراعة الخلايا بعد إضافة SBTI. باستخدام ثقافات الخلايا الظهارية في مجرى الهواء بالطريقة المنصوص عليها في هذا البروتوكول ، يمكنك متابعة ذلك باستخدام مجموعة متنوعة من طرق التحليل للنظر ، على سبيل المثال ، في الوظيفة ، والتعبير الجيني ، والإنتاج الوسيط للخلايا الظهارية في مجرى الهواء ، وبالتالي ، على سبيل المثال ، الحصول على نظرة ثاقبة لعواقب التعرض ، على سبيل المثال ، دخان السجائر. الخطوات التالية لبروتوكول زراعة الخلايا هذا هي دمج أنواع إضافية من الخلايا ، مثل الخلايا المناعية ، أو الخلايا الوعائية ، وهذا سيساعد على زيادة تمثيل الأنسجة.
