توفر زراعة الكالس النباتية حلا للتقييم الدقيق والفعال والسريع للتدهور الأيضي للأقوياء في النباتات. يمكن أن تستبعد زراعة الكالس النباتية الميكروبيوم أو التداخل الفطري والتدهور الكيميائي الضوئي ، وتبسط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة ، وتوحد ظروف الزراعة ، وتقصر مدة العلاج ، وتتطلب جهدا تجريبيا أقل. يمكن أن توفر الطريقة المقترحة هنا نظرة ثاقبة لسلوك الامتصاص وآليات التمثيل الغذائي لمختلف الملوثات العضوية على المحاصيل وهي مفيدة في الجهود المبذولة بشأن تقييمات المخاطر البيئية.
للبدء ، الأوتوكلاف جميع المعدات وإجراء جميع العمليات في مقعد عمل نظيف للغاية معقم بالأشعة فوق البنفسجية. تعقيم سطح البذور الربيعي مع 75 ٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة. شطفها بالماء منزوع الأيونات المعقم ثلاث مرات وتعقيمها مرة أخرى بنسبة 20٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 20 دقيقة.
بعد غسل البذور بالماء منزوع الأيونات المعقم ست مرات ، قم بإنباتها بشكل معقم عن طريق البذر على وسط Murashige و Skoog الخالي من الهرمونات من درجة الحموضة 5.8 يحتوي على 1٪ هلام أجار واحتضانها عند 26 درجة مئوية مع فترة تصوير 16 ساعة لمدة 15 يوما. بعد 15 يوما من حضانة البذور ، قم بقطع hypocotyl و cotyledon من الشتلات إلى قطع صغيرة من 0.5 سم للحصول على النباتات. قم بتحويل النباتات في طبق بتري يحتوي على 15 إلى 20 ملليلتر من وسط موراشيج وسكوج المعقم المكمل بأوكسيمون وفيكوسيانين واحتضانه في الظلام عند 26 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع للحث على الكالس.
باستخدام مشرط معقم وملقط ، افصل الكالس الذي يبلغ قطره حوالي سنتيمتر واحد يتكون من النباتات الأولية. للعلاج ، قم بإذابة 2،4-ثنائي بروموفينول في 10 ملليلتر من السائل المعقم Murashige ووسط Skoog. ثم أضف ثلاثة جرامات من الكالس الجزري المنفصل إلى محلول 2،4-dibromophenol المحضر.
بعد تحضير الوسيط في عنصر تحكم فارغ كما هو موضح في المخطوطة ، احتضان جميع القوارير في الظلام. لتحضير العينة ، افصل الكالس بعناية عن قارورة المعالجة 2 ، 3-ثنائي بروموفينول والتحكم عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات الألياف الزجاجية 0.45 ميكرون. اغسل الكالس ثلاث مرات بالماء عالي النقاء قبل جمعه.
قم بتجميد جميع الكالس الذي تم جمعه وتجانس 0.2 جرام من الكالس المجفف مع مطحنة أنسجة عالية الإنتاجية عند 70 هرتز لمدة ثلاث دقائق. استخدم حقنة زجاجية دقيقة لإضافة 50 ميكرولترا من 4-n-nanophenol البديل إلى الكالس والدوامة المتجانسة لمدة دقيقة واحدة. أضف خمسة ملليلتر من المحلول الذي يحتوي على نسبة متساوية من الميثانول والماء إلى الكالس المسنن وقم بصوتنه لمدة 30 دقيقة لاستخراج 2،4-ثنائي بروموفينول والمستقلبات.
بعد الاستخراج ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتعليق عند 8،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق وجمع المادة الطافية عن طريق الماصة. مرر المستخلص من خلال استخراج الطور الصلب المتوازن المحب للماء أو خرطوشة HLB-SPE بمعدل تدفق واحد ملليلتر في الدقيقة. خفف المواد المراد تحليلها عن طريق تمرير ستة ملليلترات من الميثانول عبر خرطوشة HLB-SPE.
ثم ركز المحلول الذي تم الحصول عليه إلى ملليلتر واحد تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين لتحليل فعال. للتحليل ، افتح باب سخان العمود. ثم قم بتثبيت عمود الكروماتوغرافيا السائلة فائق الأداء عن طريق توصيل مدخل العمود بصمام الحقن والمخرج بمدخل مطياف الكتلة.
أدخل نهاية أنابيب المذيبات A و B في زجاجات المذيبات المقابلة. ضع قوارير العينة حسب الرقم التسلسلي في المواقع المقابلة لصواني العينات وأعد إدخال صواني العينات في حجرة العينة. في نافذة البرنامج ، انقر فوق الأداة ، ثم طريقة المدخل لتحرير شروط الكروماتوجرام السائل.
حدد طريقة MS وقم بإعداد معلمات تحليل الطيف الكتلي. انقر فوق ملف ثم جديد لإنشاء قاعدة البيانات وتسميتها. قم بتحميل نموذج البرنامج الذي تم إنشاؤه أعلاه عن طريق تحديد ملف MS ، متبوعا بملف المدخل وحجم الحقن.
احفظ قاعدة البيانات في المجلد النموذجي للمشروع بالنقر فوق ملف وحفظ. بعد ذلك ، حدد تشغيل وابدأ في نافذة البرنامج الرئيسية وانقر فوق الحصول على بيانات نموذجية ، متبوعا بالزر "موافق" في قائمة بدء تشغيل العينة لجمع البيانات. لمعالجة البيانات ، حدد صف البيانات الهدف وانقر فوق نافذة الكروماتوجرام لعرض مخطط كروماتوجرام MS scan .
في نافذة الكروماتوجرام ، انقر فوق عرض ، متبوعا ب TIC. بعد النقر على موجة المسح DS ، أضف أثرا وموافق للحصول على مسح أطياف الكتلة الابنة. أظهر مخطط كروماتوجرام 2،4-مستخلص الجزر المعالج بثنائي بروموفينول وجود ثمانية مستقلبات مختلفة مقارنة بعينات التحكم.
بالإضافة إلى ذلك ، يشير غياب ذروة 2،4-ثنائي بروموفينول الأصل من الكروماتوجرام إلى التمثيل الغذائي السريع ل 2،4-ثنائي بروموفينول في الكالس الجزري في ظل الظروف التجريبية. علاوة على ذلك ، أدى 2،4-ديبروموفينول المحتضن في الكالس الجزري إلى تكوين المستقلبات عن طريق الاقتران المباشر مع الجلوكوز والأحماض الأمينية. يجب تعقيم جميع المعدات بالإضافة إلى وسيط Murashige و Skoog للتأكد من إجراء تمايز وصيانة الكالس النباتي في ظل ظروف معقمة.
تسمح مناهج Omics التي تتبع هذا الإجراء بإنشاء صورة ميكانيكية سامة للنباتات واضحة للملوثات البيئية.
