يركز هذا البروتوكول على قياس التنفس الميتوكوندريا للفأر والعدلات البشرية ، وكذلك خلايا HL60 الشبيهة بالعدلات باستخدام محلل التدفق الأيضي خارج الخلية. تسمح لنا هذه الطريقة بتحديد وظيفة الميتوكوندريا في العدلات في ظل الظروف العادية والمرضية. هذه تقنية مباشرة يمكنها تقديم نظرة ثاقبة لوظيفة الميتوكوندريا للخلايا استجابة للأدوية أو أي حالة مرضية.
نظرا لأن الخلايا المختلفة لها كفاءة تنفسية مختلفة في الميتوكوندريا ، يجب إجراء تحسين كثافة بذر الخلايا وتركيز الكاشف بدقة للحصول على نتائج عالية الجودة. لبدء اختبار التدفق الأيضي خارج الخلية ، خذ خرطوشة مستشعر معبأة فوق لوحة 96 بئرا مصممة خصيصا وانقل 200 ميكرولتر من وسط المعايرة إلى كل بئر من اللوحة الأساسية. ارفع الخرطوشة واللوحة بعناية باستخدام المعاير ، وضعها في حاضنة مرطبة خالية من ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل للترطيب.
بعد ذلك ، بناء على نوع الخلية ، قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بطبقة محددة لضمان التصاق الخلية. بعد ذلك ، اغسل الأطباق ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم مرتين. تحضير وسط الفحص في DMEM مع واحد مليمولار بيروفات ، 10 مليمولار الجلوكوز ، واثنين من الجلوتامين المليمول.
شراء الفأر وخلايا العدلات البشرية كما هو موضح في مخطوطة النص. بالنسبة للعدلات المشتراة من الماوس ، اضبط كثافة الخلية على 1.1 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر عن طريق إضافة وسيط الفحص. ثم بذر 180 ميكرولتر من تعليق العدلات الماوس لكل بئر في لوحة 96 بئر المعدة.
وبالمثل ، اضبط كثافة خلايا العدلات البشرية إلى 2.2 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر باستخدام وسط الفحص. في يوم الفحص ، عد خلايا HL60 الشبيهة بالعدلات يدويا باستخدام مقياس الدم. ثم قم بطرد مركزي خلايا HL60 المتمايزة أو غير المتمايزة عند 300 جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
اغسل الخلايا باستخدام DMEM مرة واحدة وأعد تعليقها في وسط الفحص لتحقيق كثافة خلية تبلغ 1.39 مرة 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر. بعد ذلك ، قم بزرع 180 ميكرولترا من خلايا HL60 المتمايزة أو غير المتمايزة في لوحة 96 بئرا المعدة مسبقا والتي تحتوي على عينات الفئران والعدلات البشرية. أخيرا ، أضف وسطا كاملا إلى آبار الزاوية للوحة زراعة الخلايا الخالية من الخلايا لتصحيح الخلفية أثناء البذر.
أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300G في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق دون انقطاع لضمان الالتصاق السليم للخلايا في الجزء السفلي من اللوحة. أخيرا ، احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة لموازنة الخلايا مسبقا مع وسيط الفحص. افتح مجموعة اختبار إجهاد الميتوكوندريا وقم بإعداد الكواشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
بعد ذلك ، قم بتحميل الخرطوشة بالكواشف ، بدءا من oligomycin المحضر في المنفذ A ، و FCCP في المنفذ B ، وخليط rotenone / antimycin A في المنفذ C للحقن. املأ المنافذ غير المستخدمة ب 20 ميكرولترا من وسيط الفحص. قم بموازنة نظام الفحص عند 37 درجة مئوية قبل خمس ساعات على الأقل من الفحص عن طريق فتح برنامج Wave والنقر فوق علامة التبويب تشغيل السخان.
بعد الوصول إلى درجة الحرارة ، تظهر الزاوية اليسرى السفلية من برنامج Wave جاهزة. افتح قالبا لمجموعة مقايسة إجهاد الميتوكوندريا في البرنامج. حدد استراتيجيات الحقن على الجانب الأيسر ، ثم انقر فوق إضافة وقم بتسمية حالة الحقن باسم العدلات البشرية أو العدلات الفأرية أو HL60.
حدد المنفذ A إلى D بالنقر فوق كل منها ، وانقر فوق إضافة مركب وأدخل oligomycin أو FCCP أو rotenone / antimycin A مع التركيزات المعنية. حدد المعالجة المسبقة على الجانب الأيسر ، ثم انقر فوق إضافة وقم بتسميتهما CD18 و Cell Tak بشكل منفصل. حدد ملف نوع الخلية على الجانب الأيسر.
ثم انقر فوق إضافة وتسميتها العدلات البشرية ، العدلات الماوس ، و HL60 أو DHL60 مع كثافة التغذية حسب الاقتضاء. حدد المجموعات بالنقر فوق إضافة مجموعة. ثم انقر فوق التعريف الذي تحته خط.
انقر فوق خريطة اللوحة في القائمة العلوية لمراقبة جميع المجموعات ذات التعريفات على الجانب الأيسر وخريطة اللوحة على اليمين. قم بالسحب والإفلات لإضافة كل بئر إلى المجموعة مع الحفاظ على آبار الزوايا الأربعة كخلفية. لإعداد البروتوكول ، حدد علامة التبويب البروتوكول في القائمة العلوية ، وحدد ثلاث دورات من خليط خط الأساس ، oligomycin ، FCCP ، rotenone و antimycin A ، عن طريق ضبط وقت الخلط على أنه ثلاث دقائق ، والراحة على أنها صفر دقيقة ، والقياس على أنه سبع دقائق.
انتقل إلى صفحة تشغيل المقايسة، وقدم معلومات ملخص المشروع كمرجع، وانقر فوق بدء التشغيل. أعط الموقع لحفظ الملفات بحيث يتم حفظ جميع النتائج بعد الانتهاء من الفحص. ثم انقر فوق بدء التشغيل مرة أخرى.
بعد التحميل التلقائي للفحص ، انتظر حتى يفتح الدرج لوضع خرطوشة المستشعر واللوحة مع 200 ميكرولتر من المعاير. اضبط اتجاه الرمز الشريطي للخرطوشة متجها إلى اليمين. قم بتشغيل المعايرة بالنقر فوق أنا جاهز، والذي يستغرق حوالي 20 دقيقة.
بعد المعايرة ، انقر فوق فتح الدرج ، واستبدل اللوحة بلوحة الخلية المصنفة ، وانقر فوق أنا جاهز لمتابعة الفحص. بعد الانتهاء من الفحص ، يتم حفظ البيانات تلقائيا. تصدير النتائج إلى جدول بيانات أو ملف برنامج تحليل آخر.
ارسم الرسم البياني وحلل البيانات. أشارت الديناميات التمثيلية لمعدل استهلاك الأكسجين أو OCR إلى تغيرات في تنفس الميتوكوندريا في الفئران والعدلات البشرية ، وكذلك خلايا HL60 غير المتمايزة والمتمايزة استجابة ل oligomycin و FCCP ومزيج الروتينون ومضاد الميسين A.انخفضت قيم OCR في جميع الخلايا بعد علاج oligomycin بسبب تثبيط قناة البروتون من ATP سينثيز. زادت معالجة FCCP من تدفق الإلكترونات واستهلاك الأكسجين لاستعادة قيمة OCR وتحقيق أقصى قدر من التنفس.
مزيج من الروتينون ومضاد الميسين A يحجب المجمعات 1 و 3 من سلسلة نقل الإلكترون ، مما يؤدي إلى القضاء على تنفس الميتوكوندريا. لوحظ انخفاض تنفس الميتوكوندريا في خلايا HL60 بعد التمايز الموجه للعدلات. وجد أن خلايا HL60 المتمايزة لها تنفس أقل بكثير من الميتوكوندريا القاعدية ، والتنفس المرتبط بتسرب البروتون ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس غير الميتوكوندريا.
لم تكن الزيادة في التنفس الأقصى لخلايا HL60 المتمايزة كبيرة ، في حين زادت القدرة التنفسية الاحتياطية بشكل كبير. تأكد من وجود الخلايا في الجزء السفلي من اللوحة ، حيث يجب ألا تحتوي خرطوشة المستشعر على أي عوائق بسبب الخلايا العائمة أثناء قراءة قيمة OCR. ستساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة تأثير الأدوية أو خلل الميتوكوندريا في الدراسات المرتبطة بالعدلات.
