استقلاب الميتوكوندريا هو منظم أساسي لمتانة الخلايا التائية والذاكرة. وبالتالي فإن قياس تنفس الميتوكوندريا يعطي رؤى مهمة حول خصائص الخلايا التائية. يمكن لآلة Seahorse قياس عناصر مختلفة من تنفس الميتوكوندريا ، في الوقت الفعلي ، في الخلايا الليمفاوية الأولية الحية البشرية ، دون الحاجة إلى أي وضع علامات.
هذه الطريقة مناسبة جدا لمراقبة لياقة الخلايا التائية وإمكانات الذاكرة ، والتي تعد تنبؤات مهمة بنجاح العلاج المناعي للسرطان. للبدء ، اغسل حبات CD3 / CD28 عن طريق نقل 12.5 ميكرولتر من الخرز لكل مليون خلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وإضافة 12.5 ميكرولتر من PBS لكل 12.5 ميكرولتر من الخرز في الأنبوب. ثم ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على مغناطيس مناسب لمدة دقيقة واحدة ، وتخلص من المخزن المؤقت ، وأعد تعليق الخرز في الحجم الأصلي لوسط الخلايا التائية.
بعد ذلك ، أضف 12.5 ميكرولتر من الخرز لكل مليون خلية بنسبة واحد إلى اثنين من الخرز إلى الخلايا ، وقسم الخلايا إلى حالتين مع حوالي خمسة ملايين خلية في كل منهما. ثم ، أضف الحجم الصحيح من السيتوكينات إلى كل حالة ، وانقل الخلايا إلى لوحات متعددة الآبار. احتضان الخلايا لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثلاثة أيام من الحضانة ، قم بإعداد وسط الخلايا التائية الطازج بضعف تركيز السيتوكينات. أعد تعليق الخلايا وقسمها عن طريق نقل نصف الحجم من كل بئر إلى بئر جديد. ثم أضف نفس الحجم من وسط الخلايا التائية الطازج إلى كل بئر.
لفحص التدفق خارج الخلية ، قم بإعداد محلول طلاء يحتوي على بيكربونات الصوديوم و Cell-Tak وهيدروكسيد الصوديوم. بعد ذلك، افتح لوحة زراعة خلايا XF جديدة، وأضف 12 ميكرولتر من محلول الطلاء المعد حديثا إلى كل بئر، مما يضمن التوزيع المتساوي لمحلول الطلاء في أسفل جميع الآبار. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة مع الغطاء لمدة 30 دقيقة.
ثم ، تخلص من المحلول السائل المتبقي من جميع الآبار. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم ، وتخلص من السائل. بعد ذلك ، اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من PBS المعقمة من فئة زراعة الخلايا.
بعد التخلص من السائل ، اترك اللوحة لتجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للوحة الخلايا التائية في لوحة زراعة خلايا XF، قم بإعداد 50 ملليلتر من وسائط الفحص عن طريق خلط وسائط XF RPMI المناسبة مع الجلوكوز والبيروفات والجلوتامين وفقا للإعداد التجريبي. سخني الوسائط المحضرة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة منظمة غير ثاني أكسيد الكربون ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4.
ضمان وسائط كافية لزراعة الخلايا وإعداد حلول oligomycin و FCCP. بعد ذلك ، قم بتصميم تخطيط لوحة مع عدد متزايد من الخلايا لكل بئر للتحسين أو تشغيل الفحص. استخدم أربعة آبار مليئة بالوسائط ومحقونة بالوسائط لقياسات الخلفية.
بعد حساب الخلايا التائية المعدة مسبقا، قم بماصة عدد مناسب من الخلايا إلى كل بئر من لوحة زراعة خلايا XF المطلية سابقا وفقا لتخطيط اللوحة. لالتصاق الخلايا التائية بالسطح المطلي، قم بالطرد المركزي للوحة زراعة خلايا XF. ثم اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من وسائط الفحص.
تخلص من الوسائط، وأضف 180 ميكرولتر من وسائط الفحص الطازجة. بعد التأكد من توصيل الخلايا وتوزيعها بالتساوي عبر سطح البئر، احتضن لوحة زراعة الخلايا XF عند 37 درجة مئوية في خزانة التسخين غير الخاضعة لثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. لتشغيل التحسين ، قم بإعداد حلول عمل oligomycin و FCCP في وسائط الفحص.
ثم قم بتحميل حلول العمل الخاصة إما ب oligomycin أو FCCP في منافذ الحقن الخاصة بخرطوشة المستشعر. تأكد من عدم احتواء منافذ الحقن على الهواء فقط. املأ جميع المنافذ الفارغة بوسائط الفحص.
ثم قم بإزالة الفقاعات المحتملة في منافذ الحقن عن طريق طرق حواف اللوحة برفق على الطاولة. لإجراء الفحص ، قم بإعداد محلول مضاد للمايسين A يحتوي على 20 ميكرومولار. ثم ، وفقا لتخطيط اللوحة ، قم بتحميل 20 ميكرولتر من oligomycin أو FCCP في منفذ الحقن A من خرطوشة المستشعر ، وأضف 22 ميكرولتر من antimycin A إلى منفذ الحقن B لجميع الآبار.
في تشغيل تحسين oligomycin التمثيلي ، يتم الوصول إلى هضبة في معدل استهلاك الأكسجين ، أو OCR ، عندما يصل التركيز التراكمي إلى ميكرومول واحد. من هذا التركيز فصاعدا ، لم يتم تخفيض OCR أكثر. بالنسبة للخلايا المعالجة بتركيزات متزايدة من FCCP غير المقترن ، زادت مستويات OCR حتى 0.2 ميكرومولار FCCP ثم وصلت إلى هضبة ، مما يشير إلى أنه تم الحصول على فك الارتباط الكامل.
في عملية تحسين تركيز الخلايا التمثيلية ، يكون التعرف الضوئي على الحروف الأولي للتشغيل مع 200،000 خلية ما يقرب من نصف ذلك ، مع 400،000 خلية. بعد علاج FCCP ، الحد الأقصى للالتعرف الضوئي على الحروف هو 61.6 بيكومول في الدقيقة ل 200،000 خلية و 190.4 بيكومول في الدقيقة ل 400،000 خلية. بعد علاج oligomycin ، ينهار OCR في الجري مع 200،000 خلية إلى أرقام مفردة وهو أقل من ذلك في الجري مع 400،000 خلية.
كشف التحقيق في تأثير السيتوكينات إنترلوكين-2 وإنترلوكين-15 على عملية التمثيل الغذائي للخلايا التائية أن الخلايا المستزرعة إنترلوكين-15 تمتلك تنفس أقصى أعلى وقدرة تنفسية احتياطية. ومع ذلك ، لم يتأثر التنفس القاعدي وإنتاج ATP. دراسة استقلاب الميتوكوندريا في الخلايا التائية البشرية يعطي أدلة مهمة على متانتها وقدرتها على البقاء على قيد الحياة.
وهذا يؤدي إلى زيادة المعرفة باللياقة البدنية للخلايا التائية ويمكن أن يحسن في نهاية المطاف معدلات الاستجابة للعلاج المناعي للسرطان.
