يعد تحليل FISH لخلايا المبيض من الإناث المصابات بانحرافات كروموسوم X تقنية فريدة لاكتساب نظرة ثاقبة على محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض في هذه المجموعة المحددة. يمكن أن تكون هذه التقنيات مفيدة لمعرفة المزيد عن إمكانات التكاثر لدى الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X. من المهم الإشارة إلى أن كلتا الطريقتين تهدفان إلى تسهيل البحث في المستقبل ، وليست مصممة لاستخدامها كأداة تشخيصية في الممارسة السريرية.
سيوضح الإجراء رونالد بيك ، كبير الباحثين في مختبر الخصوبة لدينا ، وميلاد انتصار ، المحلل من قسم علم الأمراض لدينا. للبدء ، قم بقطع أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد أو المذابة إلى قطع صغيرة واحدة تلو الأخرى بالمليمتر باستخدام مشرط. هضم شظايا الأنسجة إنزيميا في أربعة لترات من L15 قبل تسخينها لمدة 75 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ماصة خليط الهضم صعودا وهبوطا كل 15 دقيقة. أوقف الهضم الأنزيمي بإضافة أربعة ملليلتر من L15 البارد المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني أو FBS. اغسل الأنسجة المنفصلة مرة واحدة بثمانية ملليلتر من وسط L15 البارد عن طريق الطرد المركزي عند 500 جم قبل إعادة التعليق في 500 ميكرولتر من وسط L15.
انقل معلق الخلية الذي يحتوي إلى حد كبير على خلايا انسجة فردية وبصيلات صغيرة إلى طبق بتري بلاستيكي ، وافحص التعليق تحت مجهر ستيريو. اختر البصيلات التي يقل حجمها عن 50 ميكرومتر يدويا باستخدام ماصة بلاستيكية 75 ميكرومتر ، وانقلها إلى قطرة وسط L15 المكمل ب 10٪ FBS عند أربع درجات مئوية. ثم انقل البصيلات المنقاة إلى محلول 0.06٪ تربسين ، ملليغرام واحد لكل مليلتر EDTA ، وملليغرام واحد لكل مليلتر جلوكوز ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، احصل على خلايا انسجة المبيض من تعليق خلايا القشرة باستخدام ماصة بلاستيكية 75 ميكرومتر. للتهجين الفلوري في الموقع ، أو تحليل FISH لخلايا المبيض الفردية ، قم بنقل بصيلات المبيض المعالجة مع التربسين / EDTA / الجلوكوز ، أو الخلايا اللحمية إلى قطرات من خمسة ميكرولتر من 0.15 مليمول كلوريد البوتاسيوم ، و 15 ميكرولتر من DPBS على شريحة ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. جفف الشريحة وقم بتثبيتها مسبقا في 300 ميكرولتر من 0.05 مليمولار كلوريد البوتاسيوم و 7.5٪ حمض الخليك و 22.5٪ ميثانول لمدة دقيقتين.
قم بتغطية الشريحة بحمض الخليك من الميثانول ثلاثة إلى واحد لمدة دقيقتين لإنهاء التثبيت. بعد التثبيت ، اغسل العينة مرتين في SSC طازجة عند 73 درجة مئوية. قم بتغطيته ب 100 ميكرولتر من 2٪ Proteinase K وختمه بقسيمة غطاء.
احتضان الشريحة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في محطة التهجين. بعد الحضانة ، قم بإزالة قسيمة الغطاء ، واغسل الشريحة لمدة خمس دقائق في DPBS في درجة حرارة الغرفة تحت الهز. ثبت العينة لمدة خمس دقائق باستخدام 1٪ فورمالديهايد.
ثم اغسل الشريحة في DPBS ، وقم بتجفيفها بشكل متسلسل في زيادة تركيزات الإيثانول لمدة دقيقتين لكل منهما. جفف العينة في الهواء قبل تهجينها باستخدام مجسات تحمل علامات الفلورسنت. بعد ذلك ، أضف ميكرولترا واحدا من CEPX ، وميكرولترا واحدا من CEP18 ، و 18 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتهجين إلى العينة وختمه بزلة غطاء يتم لصقها على الشريحة.
انقل الشريحة إلى محطة التهجين للتمسخ عند 73 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، تليها التهجين أثناء الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية. بعد التهجين ، قم بإزالة انزلاق الغطاء وأي غراء متبقي من الشريحة. اغسل الشريحة في 0.4X SSC ، 0.3٪ Tween-20 عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها الحضانة لمدة دقيقة واحدة في 2X SSC و 0.1٪ Tween-20.
قم بتجفيف الشريحة كما هو موضح ، وجففها في الهواء في الظلام قبل تغطيتها بوسط تثبيت يحتوي على DAPI. ضع الشريحة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق قبل تحليلها بواسطة المجهر الفلوري. لتهجين مقاطع البارافين، حدد أقساما جديدة قبل، أو بعد القسم الذي يحتوي على بصيلات من شريط البارافين.
قم بتركيب قسم واحد على شريحة زجاجية ، وجففه لمدة 45 دقيقة على موقد عند 56 درجة مئوية. قم بإزالة المقطع في الزيلين لمدة 10 دقائق ، ثم اغمر الشريحة في 99.5٪ إيثانول ، واشطفها لمدة خمس دقائق في ماء الصنبور. قم بمعالجة الشريحة مسبقا بمحلول الاسترجاع المستهدف لمدة 10 دقائق عند 96 درجة مئوية.
بعد التبريد ، شطف الشريحة في الماء المقطر. عالج الشريحة لمدة خمس دقائق ب 0.01 حمض الهيدروكلوريك المولي ، يليها هضم البيبسين لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شطف الشريحة مرة أخرى في حمض الهيدروكلوريك وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني.
إصلاح الشريحة في 1 ٪ الفورمالديهايد PBS لمدة خمس دقائق. ثم اشطف الشريحة لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ، ومرة أخرى في الماء منزوع المعادن قبل تجفيفه في 99.5٪ إيثانول. ضع خمسة ميكرولترات من المسبار CEP18 و CEPX على الشريحة المعالجة مسبقا.
ثم ضع زلة غطاء وأغلق المنطقة بغراء الصور. ضع الشريحة في جهاز هجين للتمسخ عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق والتهجين طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اشطف الشريحة مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما في SSC عند 42 درجة مئوية ، تليها دقيقتان ودقيقة واحدة شطف في 0.3٪ Nonidet P-40 عند 73 درجة مئوية.
مرة أخرى ، اشطف الشريحة في 2X SSC متبوعا بالشطف بالماء المقطر قبل تجفيفها بنسبة 99.5٪ إيثانول. جفف الشريحة في الهواء ، وقم بتركيبها في وسط تركيب يحتوي على DAPI. أظهرت أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد في المريض A 50٪ من الخلايا الليمفاوية ، وكان لديها 45 ، النمط النووي X ، و 50٪ لديها 46 ، XX.In المريض B ، 38٪ من الخلايا الليمفاوية كانت 45 ، X ، 28٪ كانت 46 ، XX ، و 34٪ كانت 47 ، XXX.
كما تم تحليل الخلايا اللحمية المحيطة لمحتوى كروموسوم X. أدى الهضم الأنزيمي لأنسجة قشرة المبيض إلى تعليق الخلايا المنفصلة إلى حد كبير ، ولكن ترك البصيلات البدائية ، التي تتكون من بويضة سليمة محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية. قدمت بصيلات صغيرة صعوبات في تفسير الإشارات بعد FISH ، بسبب تكتل الخلايا الحبيبية.
أدى الهضم الإضافي للبصيلات مع التربسين قبل FISH إلى تقلص الخلايا الحبيبية الفردية في مورفولوجيا كروية على سطح البصيلات. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين بصيلات ثانوية وغارية طبيعية شكليا في أنسجة قشرة المبيض بعد خمسة أشهر من التطعيم الغريب. تم تحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية لهذه البصيلات عن طريق تحليل FISH.
أدى تثبيت أنسجة قشرة المبيض المطعمة في محلول بوين إلى إشارات فلورية غير واضحة ومحجوبة إلى حد كبير في الخلايا المسامية بسبب الضباب الأخضر. في المقابل ، قدمت أنسجة قشرة المبيض المثبتة في الفورمالديهايد إشارات فلورية ممتازة. يكمن التحدي الرئيسي لهذا البروتوكول في عزل خلايا المبيض والهضم الأنزيمي للأنسجة.
يمكن أن يتسبب الانحراف عن هذا البروتوكول في فقدان كبير لخلايا المبيض أثناء العملية ، ويجب تجنب ذلك بشكل خاص عند الإناث اللائي لديهن بالفعل احتياطي مبيض منخفض. يمكن أن يكون التنميط الإضافي للتعبير الجيني مفيدا لمعرفة المزيد عن تأثير خلايا المبيض اختلال الصيغة الصبغية على تكوين الجريبات ، وبالتالي عملية فشل المبيض المبكر في الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.
