0. يصف بروتوكولنا طريقة محسنة وقابلة للتكرار لتوليد ناقضة العظم في المختبر والتي يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الكامنة وراء عملية التمايز ووظائفها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على توليد أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة للعظم النشطة وظيفيا في غضون أسبوع واحد فقط. يتم تحقيق عائد تمايز عالي باستخدام الخلايا الوحيدة المنقاة وإضافة السيتوكينات في الوقت المحدد.
الخلايا الآكلة للعظم هي المسؤولة عن تدمير العظام في جميع أشكال التهاب المفاصل ، وتوفر هذه الطريقة الأدوات اللازمة لفحص المركبات العلاجية الجديدة التي يمكن أن تعدل تمايزها و / أو وظائفها. سيكون إثبات الإجراء باتريشيا ريدلوفا ، طالبة دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، اعزل PBMCs عن طريق نقل الدم إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.
تمييعه مع PBS معقمة في حجم متساو للدم الطازج ، أو نسبة 1: 3 لمخاريط الكريات البيض والمعاطف بافي. خلط الدم بلطف عن طريق الانقلاب. قم بإعداد أنابيب سعة 15 ملليلترا تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة ، وقم ببطء بطبقة من ثمانية إلى 10 ملليلتر من الدم المخفف على الجزء العلوي من وسط تدرج الكثافة ، وتجنب الخلط.
جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بدون فرامل. ثم تخلص بعناية من الطبقة العليا باستخدام ماصة باستور. اجمع الطبقة السفلية البينية التي تحتوي على PBMCs ، وانقل هذه الطبقة إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.
قم بتعليق الخلايا حتى 50 ملليلتر باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، واغسل وسط تدرج الكثافة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل الكاملة. لإزالة الصفائح الدموية المتبقية ، كرر عملية الطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة ، وأعد تعليق PBMCs المعزولة والمنقاة في 20 ملليلتر من PBS ، وعدها باستخدام مقياس الدم باتباع الطريقة القياسية. لإثراء CD14 + monocytes ، انقل 1 × 10 إلى PBMCs السابعة إلى أنبوب بوليسترين مستدير القاع مناسب ، وقم بتجميع الخلايا عند 300 × جم لمدة خمس دقائق.
بعد التخلص من المادة الطافية وتعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت لفصل الخلايا ، احتضن الخلايا ب 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل 100 ميكرولتر مع الغطاء لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من حبات الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر ، واحتضانها لمدة ثلاث دقائق مع الغطاء. قم بزيادة الحجم إلى 2.5 ملليلتر باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلايا.
ضع الأنبوب في مغناطيس ، واحتضانه لمدة ثلاث دقائق مع إزالة الغطاء. الآن ، تجاهل مجتمع الخلايا السالبة بحركة واحدة مستمرة عن طريق الانقلاب بينما لا يزال الأنبوب في المغناطيس. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، واغسل الخلايا الوحيدة CD14 + المخصبة المتصلة بالخرز المغناطيسي عن طريق تعليقها في 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت لتعليق الخلية ، ثم ضع الأنبوب مرة أخرى في المغناطيس.
عد الخلايا المعزولة كما هو موضح سابقا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها في 300 × غرام لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا بمعدل 1 مليون خلية لكل مليلتر في الحد الأدنى من الوسط الأساسي ألفا الكامل مع 10٪ FBS.
للتمييز بين ناقضة العظم ، أضف M-CSF بتركيز نهائي يبلغ 25 نانوجرام لكل ملليلتر إلى تعليق الخلية ، واخلطه عن طريق السحب جيدا لتجانس تعليق الخلية. لوحة 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في لوحة مسطحة القاع 96 بئر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم لكل بئر حول الخلايا المطلية لمنع التبخر المتوسط وتأثيرات الحافة في نظام الاستزراع.
احتضان الخلايا طوال الليل لمدة 18 إلى 20 ساعة تقريبا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإعداد وسائط جديدة مكملة ب M-CSF و RANK ligand. بعد الحضانة ، قم بإزالة نصف الوسط بعناية عن طريق الشفط باستخدام ماصة P200 ، واستبدله بوسط كامل طازج ودافئ مكمل ب M-CSF و RANK ligand بتركيز نهائي يبلغ 25 نانوجرام لكل ملليلتر.
قم بتفريق الخلايا إلى ناقضات عظمية لمدة سبعة إلى 14 يوما مع استبدال كامل للوسط كل ثلاثة أيام. بعد إزالة الوسط ، قم بإصلاح الخلايا العظمية الملتصقة المتمايزة ب 100 ميكرولتر لكل بئر من المحلول المثبت المحضر ، واحتضانها لمدة دقيقة واحدة. لا تلمس قاع الآبار لتجنب خدش الخلايا الملتصقة.
بمجرد غسل الآبار ثلاث مرات ب 300 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، جفف الألواح ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين الطازج إلى كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول التلوين عن طريق الانقلاب وغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر لكل بئر من الماء المقطر.
قم بإزالة الماء الزائد عن طريق النقر على الأطباق على مناشف ورقية ، واترك الأطباق مفتوحة ومحمية من الضوء إلى الهواء الجاف طوال الليل. باستخدام مجهر برايت فيلد مع خيار البلاط ، التقط صورا بمعدل 10 أضعاف أو 20 ضعفا لالتقاط سطح البئر بالكامل. عد يدويا الخلايا العظمية المحددة على أنها خلايا ملطخة أرجوانية TRAP + تحتوي على أكثر من ثلاث نوى باستخدام برنامج تحليل الصور مع مكون إضافي لعداد الخلايا.
لوحة 100 ميكرولتر من CD14 + monocytes-per-well المعزولة في شريحة حجرة مكونة من 18 بئرا بكثافة خلية 1 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر. قم بتمييز الخلايا الآكلة للعظم في وجود M-CSF و RANK ligand كما هو موضح سابقا مع تغيير كامل للوسط كل ثلاثة أيام. في نقطة وقت النهاية ، قم بإزالة الوسط برفق واغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا عند درجة الحموضة 7.4.
لا تدع الآبار تجف بين الخطوات. ثبت العينة بمحلول 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني.
قم بتخلل الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول Triton x-100 المخفف بنسبة 0.1٪ في برنامج تلفزيوني ، واحتضانه لمدة 10 دقائق كما هو موضح سابقا. اغسل مرتين مع 200 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني. لمنع الارتباط غير المحدد وزيادة الإشارة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب المصنوع من 2٪ ألبومين مصل البقر ومحلول PBS.
احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري مع اهتزاز لطيف. بعد إزالة محلول الحجب ، أضف 100 ميكرولتر من محلول القضيب المترافق بالفلورسنت المخفف في محلول 2٪ BSA / PBS لكل بئر. اغسل مرتين مع 200 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني.
تلطيخ النوى ب 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول PBS يحتوي على 300 نانومول DAPI. بعد 10 إلى 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول DAPI واستبدله ب 100 ميكرولتر لكل بئر PBS. تصور التلوين باستخدام المجاهر المناعية المناسبة أو المجاهر متحدة البؤر من أربعة إلى 40x.
يتم تعريف الخلايا العظمية الناضجة على أنها TRAP + خلايا نواة متعددة. أنتجت إضافة ليجند RANK أعدادا متزايدة من الخلايا العظمية الكبيرة TRAP + متعددة النوى بطريقة تعتمد على الجرعة. تم التحقيق في حركية تمايز ناقضة العظم من الخلايا الوحيدة على مدى فترة استزراع من يومين إلى 14 يوما.
كانت الخلايا العظمية متعددة النوى مرئية من اليوم الخامس فصاعدا ، وتم الوصول إلى التمايز الأمثل في اليوم السابع. يسمح تمايز الخلايا الآكلة للعظم على الأسطح المعدنية بتقييم نشاط ارتشافها من خلال تحليل تكوين ثقوب مستديرة أو حفر ارتشاف. تزداد نسبة الارتشاف بشكل كبير في وجود M-CSF و RANK ligand عند مقارنتها ب M-CSF وحدها.
علاوة على ذلك ، فإن العلاج بجرعة الروتينون التي تعتمد على جرعة تمنع ارتشاف السطح المعدني مقارنة ببئر التحكم غير المعالج. ارتبط تثبيط الروتينون المعتمد على ارتشاف ناقضة العظم بتثبيط إنتاج ATP. لوحظ تجزئة حلقة الأكتين المشتقة من RANK ligand من OCS الناضجة في وجود الروتينون.
من المهم التأكد من أن الخلايا الوحيدة المخصبة لا تحتوي على الصفائح الدموية ، وأن الخلايا مطلية بالكثافة المناسبة ، وأن الآبار المحيطة مملوءة بالماء لتجنب تأثير الحافة. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص للاستجواب الميكانيكي لكيفية تشكل الخلايا الآكلة للعظم ، وما الذي يؤثر على وظائفها في كل من العلوم الأساسية والانتقالية. على سبيل المثال ، باستخدام المركبات أو البروتينات التي يمكن أن تعدل هذه العمليات.
