تعد الدراسات الوظيفية لجينات الريكتسيا ضرورية لفهم دورها في التسبب في المرض ، لذلك نحن بحاجة إلى طرق يمكن الاعتماد عليها لتغيير الجينات بطريقة خاضعة للرقابة. يستخدم بروتوكولنا التثقيب الكهربائي لإدخال الحمض النووي الخارجي في البكتيريا داخل الخلايا الملزمة من جنس Rickettsia ، مما يسمح لنا بدراسة تأثيرات الحمض النووي المدخل. ستوضح ليزا برايس الإجراء معي اليوم ، وهي باحثة من الدكتور مونديرلوه ومختبر الدكتور كورتي.
للبدء ، قم بإعداد 90 إلى 100٪ من زراعة خلايا ISE6 المصابة بالريكتسيا باركيري كما هو موضح في النص. بعد ذلك ، لتحديد معدل الإصابة عن طريق تلطيخ Giemsa ، قم بتخفيف تعليق الخلية إلى نسبة 1: 5 مع وسيط كامل وإيداع 100 ميكرولتر من معلق الخلية على شريحة مجهر زجاجي عن طريق الطرد المركزي عند 113 جم لمدة خمس دقائق. بعد ترك الشريحة تجف في الهواء ، قم بإصلاحها ميثانول مطلق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم احتضان الشريحة وبقعة Giemsa لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اشطف الشريحة بالماء وبمجرد أن تجف ، اعرضها تحت المجهر الضوئي مع أهداف الزيت. أوجد النسبة المئوية للخلايا المصابة عن طريق عد الخلايا المصابة وغير المصابة.
لتحضير Rickettsia parkeri الخالية من الخلايا ، صب حوالي 0.2 ملليلتر من حبيبات كربيد السيليكون المعقمة من 60 إلى 90 في أنبوبي طرد مركزي معقمين سعة 2 ملليلتر وضع الأنابيب جانبا. من قارورة مصابة بالريكتسيا باركيري تم تلقيحها مسبقا تحتوي على خمسة ملليلتر من الوسط ، قم بإزالة ملليلتر من الوسط ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا مع الثلاثة ملليلتر المتبقية من الوسط.
قسم هذا التعليق بالتساوي بين أنبوبي حبيبات كربيد السيليكون المحضرين ودوامة الأنبوب بسرعة عالية لمدة 30 ثانية. ثم ضعهم على الثلج. بعد ذلك ، قم بإعداد حقنة قفل معقمة سعة خمسة ملليلتر عن طريق تمديد المكبس وإدخال طرف المكبس في قاعدة من البوليسترين تستخدم لحمل أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر.
باستخدام ماصة باستور حاجزة 2 ملليلتر تعمل مع لمبة مطاطية ، قم بإزالة طافي خلايا الدوامة بعناية دون استنشاق أي حصى. بعد ذلك ، أدخل طرف الماصة في فتحة محور المحقنة وأخرج المحتويات في المحقنة بضغط لطيف. بعد ذلك ، قم بتصفية مزرعة Rickettsia parkeri في أنابيب معقمة سعة 1.5 ملليلتر من خلال مرشح معقم بحجم مسام ميكرومتر اثنين مثبت على محور المحقنة وأجهزة طرد مركزي للأنابيب عند 13،600 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل حبيبات الخلية مرتين باستخدام 1.2 ملليلتر من محلول السكروز المثلج المثلج 300 ملليمولار. جهاز طرد مركزي للعينة وإزالة المادة الطافية بين الغسيل. في نهاية الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات الخلية المجمعة ب 100 إلى 150 ميكرولتر من محلول السكروز المثلج لعينتين إلى ثلاث عينات تحويل ، على التوالي.
بعد ذلك ، قسم العينة إلى حصص 50 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة مبردة مسبقا ومعقمة سعة 1.5 ميكرولتر. للتحول في ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد pRAM18sSFA الخالي من السموم الداخلية إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من ريكتسيا باركيري على الجليد ويقلب برفق بطرف ماصة. انقل الخليط إلى كفيت كهربي معقم مبرد مسبقا بحجم فجوة 0.1 سم.
اضغط برفق على الكوفيت لتوزيع الخليط بالتساوي واحتضانه على الثلج لمدة 10 إلى 30 دقيقة. في هذه الأثناء ، قم بإزالة الوسط من قارورة زراعة خلايا ISE6 المستزرعة مسبقا وأعد تعليق طبقة الخلية عن طريق شطف الخلايا برفق باستخدام 1.5 ملليلتر من الوسط الطازج الذي يحتوي على بيكربونات الصوديوم ومخزن HEPES. بعد توليد تعليق خلية متجانسة ، انقل الحجم بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم واحد سعة 2 ملليلتر.
بعد ذلك ، قم بالكهرباء خليط ريكتسيا باركيري والحمض النووي البلازميد باستخدام جهاز كهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، استخدم ماصة معقمة ذات طرف رفيع ممتد لنقل كمية صغيرة من تعليق خلية ISE6 إلى الكوفيت وماصة برفق لأعلى ولأسفل لاستعادة ريكتسيا باركيري الكهربائي. بعد ذلك ، انقل محتويات الكوفيت إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر يحتوي على ما تبقى من معلق الخلية ISE6.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة في درجة حرارة الغرفة ، أولا عند 700 G لمدة دقيقتين لسحب خلايا ISE6 لأسفل ، ثم عند 13،600 G لمدة دقيقة واحدة لسحب Rickettsia لأسفل. احتضان الأنبوب عند 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد الحضانة ، انقل المحتويات المعاد تعليقها لتحول واحد إلى قارورة واحدة لثقافة الخلية 25 سم مربع تحتوي على 3.5 ملليلتر من الوسط الطازج مع بيكربونات الصوديوم وعازلة HEPES.
هز القارورة لنشر الخليط بالتساوي واحتضانه عند 34 درجة مئوية. بعد 16 إلى 24 ساعة ، أضف 10 ميكرولتر من كل من سبكتينومايسين والستربتومايسين في القارورة المحتضنة. هز القارورة لخلط المضادات الحيوية بالتساوي في الوسط قبل إعادة القارورة إلى الحاضنة.
كان التكاثر الناجح لخلايا Rickettsia parkeri و ISE6 من النوع البري واضحا من خلال تلطيخ Giemsa. يمكن رؤية نوى خلايا ISE6 الملطخة باللون الأرجواني الداكن مع Giemsa في الريكتسي داخل الخلايا وكذلك خارج الخلية. تم تأكيد تحول Rickettsia parkeri الذي يعبر عن بروتين التألق الأحمر في خلايا ISE6 عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بعد سبعة أيام من الحضانة.
لوحظت زيادة كبيرة في معدل الإصابة بعد 10 أيام. حافظ على كل شيء معقم خلال العملية بأكملها. انتبه إلى التفاصيل وكن صبورا ، لأن بعض أنواع الريكتسيا تستغرق وقتا طويلا للتحول ، وخاصة المتعايشات الداخلية البطيئة النمو.
مكن هذا البروتوكول من دراسة جوانب متعددة من بيولوجيا الريكتسيا وتفاعلاتها مع ناقلات المفصليات ومضيفات الثدييات. على سبيل المثال ، تم استخدام ريكيتسي المعبرة عن البروتين الفلوري لتتبع الحركة وتفاعلات خلايا القراد المتعايشة.
