تمكن هذه الطريقة من تسجيل إمكانات الفعل داخل الخلايا على حد سواء على MEA'S التقليدية ، مما يسمح بوصف أفضل لشكل AP وتصنيف أكثر حساسية للإمكانات المؤيدة لاضطراب النظم. بالمقارنة مع التسجيلات النموذجية لإمكانات المجال ، يوفر الشكل الفعلي للجهد داخل الخلايا على حد سواء مزيدا من التبصر في التفويض الدقيق للقنوات الأيونية الأساسية. عند تطبيقها على خلايا عضلة القلب المشتقة من المرضى السريريين من خلال تقنية الخلايا الجذعية ، يمكن أن تساهم الطريقة في التشخيص السببي ، وتخصيص C R P وأمراض القلب مثل عدم انتظام ضربات القلب سيوضح الفني لدينا ، كارين جيبهاردت ، زراعة خلايا عضلة القلب.
لبدء تغطية حقول القطب الكهربائي ل MEA المعقمة سابقا ، Dropwise مع الفبرونيكتين باستخدام ماصة 10 ميكرولتر تحت غطاء التدفق الصفحي. لتقليل الصدمة التناضحية، انقل محلول الطلاء بالتنقيط لمدة 90 ثانية إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر يحتوي على خلايا عضلية قلبية مذابة. أضف برفق ثمانية ملليلتر من وسط الطلاء في الأنبوب واخلط تعليق الخلية بعناية.
باستخدام ماصة 10 ملليلتر ، قم بإزالة المادة الطافية ، وتأكد من عدم التخلص من الحبيبات وضبط رقم الخلية على التركيز النهائي. قبل الجلوس الخلوي ، قم بإزالة محلول الطلاء المطبق من منطقة القطب الكهربائي MEA باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر. لتجنب تجفيف بذور الطلاء ، تقوم الخلايا على الفور بإضافة أربعة ميكرولترات من الخلايا بالتنقيط الكهربائي على حقول القطب الكهربائي لكل من ستة بئر MEA وبئر واحد M E A.Now ، اسمح للخلايا بالالتصاق بالآبار لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تحت غطاء التدفق الصفحي ، أضف 200 ميكرولتر ومليلتر واحد من وسط الطلاء المعقم المسخن إلى 37 درجة مئوية لستة بئر MEA ، وبئر واحد MEA على التوالي. بالنسبة لتسجيلات MEA ، ضع نظام MEA أعلى الجهاز مع توسيط حامل شريحة MEA فوق فتحة الهدف. ثم اسمح لليزر بالتركيز على الأقطاب الكهربائية عن طريق وضع إعداد MEA ، بحيث يكون الهدف مباشرة تحت فتحة نظام MEA.
للسماح للخلايا بالتعافي من الاضطراب الميكانيكي ، انقل شريحة MEA مع الخلايا المزروعة من الحاضنة إلى إعداد MEA قبل 15 دقيقة من التسجيل. بعد ذلك ، قم بتنظيف وسادات ودبابيس التلامس بعناية ، باستخدام مسحة الأيزوبروبانول لتقليل مستويات الضوضاء. ضع MEA بعناية في إعداد MEA ، وضع شريحة MEA ذات الستة آبار مع الرقم التسلسلي المرئي على الجانب الأيمن أو شريحة MEA بئر واحدة مع القطب المرجعي إلى اليسار.
الآن ، اضبط نظام التسخين المتكامل MEA على 38 درجة مئوية. أغلق غطاء الجهاز لأن مفتاح الأمان المدمج يسمح فقط بتنشيط الليزر إذا كان الغطاء مغلقا فوق شريحة MEA. باستخدام برنامج تكوين MEA ، قم بتعيين مرشح نظام MEA للتمرير العالي والتمرير المنخفض إلى 0.1 هرتز أو أقل و 3،500 هرتز على التوالي.
استخدم برنامج MC rack أو أي برنامج بديل للتسجيل. اضبط نطاق الإدخال وفقا للتجربة. التأكد من أن الإشارة لا تشبع مكبر الصوت ومعدل أخذ العينات.
استخدم وظيفة العرض طويلة المدى للبرنامج للتحقق من التسجيل. بعد إدخال شريحة MEA في إعداد MEA ، وإعداد البرنامج ، قم بتهيئة ميكانيكا الليزر باستخدام برنامج FB ALP. الآن ، انقر فوق زر التهيئة.
في نهاية التهيئة ، ستكون نقطة الليزر الافتراضية في البئر D لستة آبار MEA وفي أسفل اليسار لبئر واحد MEA على التوالي. ثم باستخدام مفتاح التحكم بنقرة ماوس ، انقل نقطة الليزر الافتراضية إلى منتصف القطب الخامس D واضبط التركيز عن طريق الضغط على مفتاح التحكم والتمرير باستخدام عجلة الماوس. بدلا من ذلك ، استخدم وظيفة التركيز التلقائي.
اضغط على الزر Set P one ، وستنتقل نقطة الليزر الافتراضية تلقائيا إلى البئر F.النظام محاذ الآن. اضبط طاقة الليزر ووقت المعالجة وفقا للمتطلبات التجريبية. لتمكين الليزر ، انقر فوق زر إيقاف تشغيل الليزر الذي سيظهر كليزر قيد التشغيل ، وقم بالتبديل إلى برنامج التسجيل.
اختر اسم ملف وانقر على زر التسجيل الأحمر متبوعا بزر التشغيل أعلى النافذة لتسجيل القياس. قبل فتح الخلايا بالليزر ، سجل خط أساس لمدة 60 ثانية. قم بالتبديل مرة أخرى إلى برنامج التهيئة وقم بإلغاء تنشيط الأقطاب الكهربائية ليتم استبعادها بواسطة الليزر على الخريطة الافتراضية على الجانب الأيمن من نافذة البرنامج.
لبدء الليزر ، استخدم النقر بالماوس البديل ، وحدد القطب المركزي لهذا البئر. يؤدي هذا إلى بدء الليزر لفتح الخلايا الموجودة على كل قطب كهربائي من هذا البئر تلقائيا ، كرر لكل بئر لفتح جميع الأقطاب الكهربائية التي تم تنشيطها مسبقا لهذا البئر المحدد. قم بإذابة تركيز المليمولار من نيفيديبين E-40 31 ، ودوفيتيلايد في DMSO أولا ، ثم في وسط كامل إلى 10 أضعاف التركيز المطلوب.
لا تتجاوز أبدا تركيز DMSO النهائي بنسبة 0.1٪ في البئر. سجل نشاط خط الأساس لمدة 60 ثانية. ابدأ عملية التحفيز المستحث بالليزر كما هو موضح سابقا ، مما أدى إلى تحويل FPS إلى liAPs.
تطبيق جميع الأدوية كتركيز واحد لكل بئر. قم بإزالة 20 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من المتوسط لكل بئر من ستة بئر وبئر واحد على التوالي. أضف 20 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر من محلول مخزون الدواء ليتم قياسه إلى البئر.
اعتمادا على نوع MEA ، وبعناية ماصة صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات. اترك المركبات تغسل لمدة 300 ثانية. خلال هذا الوقت ، قد يتحول شكل liAP إلى شكل FP.
مرة أخرى ، يقوم الليزر المستحث ب peration وتسجيل العيوب المستحثة المركبة المحتملة على liAP لمدة 60 ثانية إضافية. أدت إضافة نيفيديبين إلى تقليل مرحلة الهضبة من liAPs بطريقة تعتمد على التركيز ، وبالتالي تقصير liAP بأكمله. كان هذا التقصير مشابها للإمكانات الميدانية لخلايا عضلة القلب من الأقطاب الكهربائية غير المعالجة.
E-40 31 تمنع إعادة استقطاب قنوات البوتاسيوم KV ذات الصلة نقطة واحدة 11 وأدت إلى سلوك عدم انتظام ضربات القلب في تركيزات متزايدة. أيضا ، زاد E-40 31 من مدة liAP بطريقة تعتمد على التركيز. في نهاية liAP ، لوحظت انحرافات صغيرة للجهد الإيجابي عند 0.1 ميكرومولار والتي أصبحت أكثر بروزا مع تركيزات أعلى ، مما يشير إلى إزالة استقطاب جديدة عابرة تسمى EAD's.
عند أعلى تركيز يبلغ 0.1 ميكرومولار ، تصاعدت EAD بمرور الوقت إلى نبضات خارج الرحم. وهي إمكانات الفعل السابق لأوانه. تعتبر EAD ودقات خارج الرحم من المؤشرات الرئيسية للنشاط المؤيد لعدم انتظام ضربات القلب.
وفي النهاية ، يؤدي النشاط الكهربائي إلى عدم انتظام ضربات القلب. ارتبطت علاقات استجابة التركيز بتسجيلات FP و liAP. علاوة على ذلك ، في وجود dofetilide ، عرض كل من FP و liAP فترات تقارب ثانيتين داخل نفس البئر ، قدم شكل موجة FP انحرافات إعادة استقطاب منتظمة.
بينما في liAP EAD قابلة للكشف. من المهم ضبط التركيز قبل كل ميلومين لأن صورة المجهر خارج التركيز يمكن أن تؤثر على فتح الخلايا. أيضا ، يتم أخذ جهد الفعل بعد فترة وجيزة من استخدام opterperation للتحليل.
هذه التقنية أكثر حساسية في الكشف عن تأثيرات عدم انتظام ضربات القلب السابقة مقارنة ب MEA القياسي ، مما يسمح باكتشاف الآثار المركبة الضارة بشكل أكثر دقة.
