يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل

توفر هذه الطريقة طريقة لتضخيم الإشارة من أحداث الربط إلى شكل يمكن اكتشافه بصريا للاستخدام المنخفض للموارد أو يمكن قياسه كميا باستخدام الأجهزة القائمة على الامتصاص. هذا بروتوكول سريع نسبيا من وعاء واحد لتحديد وجود هدف aptamer في عينة من الاهتمام. يمكن مقارنة النتائج بمنحنى معايرة قياسي إذا كان القياس الكمي مطلوبا.

يجب أن يكون الأفراد دقيقين للغاية عند نقل الحلول وخلطها ، لأن الخلط غير الكافي سيؤدي إلى نتائج سلبية. تأكد أيضا من الحفاظ على تبريد الكواشف والمحاليل حتى استخدامها لتقليل إشارة الخلفية. ابدأ بتنشيط منتجات انقسام الريبوزيم بإضافة خمس وحدات من كيناز متعدد النوكليوتيد T4 في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل.

ثم أضف ميكرولترا واحدا من محلول الريبوزيم 5X المعد مسبقا إلى كل أنبوب عينة. لإثبات الخصوصية بصريا ، أضف 1.5 ميكرولتر من الثيوفيلين الملي أو اثنين من الكافيين المليمولي إلى كل أنبوب عينة كعينات اختبار واخلط كل عينة جيدا عن طريق سحب خمس إلى 10 مرات. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر من 600 من الحمض النووي الريبي النانوي يحتوي على مجال أبتاميري محدد الهدف لكل أنبوب عينة ، متبوعا بسحب لخلط المكونات بسرعة.

الآن ، ضع الأنبوب على كتلة باردة لتقليل إشارة الخلفية. بعد تحضير جميع أنابيب التفاعل ، احتضان كل عينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق بالضبط. في نهاية الحضانة ، أعد أنابيب العينة إلى الجليد على الفور.

أضف 3.5 ميكرولتر من خليط إنزيم نيكيس بوليميراز إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا. بعد ذلك ، أضف 31.5 ميكرولترا من خليط تفاعل EXPAR الذي يحتوي على نيوكليوتيدات نموذجية ومخزن مؤقت للتفاعل إلى كل أنبوب عينة واخلطه عن طريق الماصة. بمجرد تحضير جميع العينات ، احتضن العينة المحضرة على حرارة 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق باستخدام جهاز توقيت.

أعد أنابيب العينة على الفور إلى الجليد بعد الحضانة. أضف 2 ميكرولتر من محلول الهيمين إلى كل أنبوب عينة لتطوير اللون واخلطه جيدا. بعد ذلك ، أضف 58 ميكرولترا من محلول TMB المتاح تجاريا إلى كل أنبوب عينة ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لتطوير اللون.

اقرأ العينات نوعيا بالعين أو حدد النتائج باستخدام قارئ لوحة الامتصاص ، كما هو موضح في المخطوطة. يمكن للبنية المحسنة التعرف على أقل من 500 ثيوفيلين نانومولار في 30 دقيقة. تنتج مستحضرات العينات المعرضة للهدف لونا أزرق ، بينما تظل العينات التي لا تحتوي على هدف عديمة اللون.

تم إعداد منحنى قياسي من الإشارة المقاسة عند A450 بعد 30 دقيقة من تطوير اللون. من المهم الاحتفاظ بالعينات على الجليد عند عدم إجراء عمليات الحضانة ، حيث سيظل حتى الحمض النووي الريبي المحسن يظهر مستوى نشاط منخفض في الخلفية.