يتيح التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكننا تحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالساق على مستوى الخلية المفردة في قنديل البحر كلادونيما. يمكننا تصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية والخلايا المتكاثرة في نفس عينة قنديل البحر ، مما يسمح باكتشاف الخلايا الجذعية المتكاثرة وغير المتكاثرة ، مما يؤدي إلى فهم عدم تجانس الخلايا الجذعية.
علم الأحياء التنموي ودراسات التجديد باستخدام نماذج حيوانية تتضمن الخلايا الجذعية. قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية دون أي نظام متخصص. Cladonema medusae لها مخالب متفرعة.
يحدث التفرع في موقع جديد على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الحافة. يمكن أن تتجدد المجسات أيضا في غضون أيام قليلة من البتر.
الحجم الصغير وسهولة التعامل ووجود الخلايا الجذعية البالغة أو الخلايا الشبيهة بالجذع تجعل Cladonema نظاما جيدا للتحقيق في دور الخلايا الجذعية في العمليات المختلفة. للبدء ، ضع Cladonema medusae في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة نقل 3.5 ملليلتر وأضف ASW حتى إجمالي حجم 500 ميكرولتر. أضف 7.5 ميكرولتر من محلول مخزون EdU 10 مليمولار واحتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية.
انتظر لمدة ساعة وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من ASW الذي يحتوي على EdU. بعد تخدير medusae ، احتضان لمدة خمس دقائق. إصلاح medusae بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في ASW.
لعلاج البروتيناز وما بعد التثبيت ، قم بإزالة البارافورمالدهيد واغسل العينات باستخدام PBS التي تحتوي على 0.1٪ توين 20 ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. قم بإزالة PBST وإضافة المخزن المؤقت للتهجين. احتضان العينات في المخزن المؤقت للتهجين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين وأضف المخزن المؤقت للتهجين الجديد. قبل التهجين عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل في حاضنة التهجين. قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين واحتضان المخزن المؤقت للتهجين الذي يحتوي على المجسات.
تهجين عند 55 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة في حاضنة التهجين. بعد ذلك ، تابع إزالة المسبار. ابدأ بإزالة المخزن المؤقت للتهجين الذي يحتوي على مجسات ثم أضف محلول الغسيل العازل الأول.
اغسل العينات بمحلول الغسيل مرتين لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الأول وأضف المخزن المؤقت للغسيل اثنين. اغسل العينات بمحلول غسيل مرتين لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل الثاني ثم أضف 2X SSC. اغسل العينات باستخدام 2X SSC مرتين لمدة 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية. قم بإزالة 2X SSC ثم أضف PBST المسخن مسبقا.
اغسل العينات لمدة 15 دقيقة باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة. لحضانة الأجسام المضادة المضادة ل DIG ، ابدأ بإزالة PBST ثم أضف 1٪ من المخزن المؤقت للحظر. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أثناء الهز ببطء على الروك.
بعد الحظر ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بنسبة 1٪. أضف محلول مضاد ل DIG-POD واحتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية. للكشف عن المسبار المسمى DIG ، قم بإزالة المحلول المضاد ل DIG-POD وأضف محلول تريس كلوريد الصوديوم توين المؤقت.
اغسل العينات باستخدام محلول تريس كلوريد الصوديوم توين ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تمييع صبغة الفلورسنت مترافق محلول مخزون تيراميد في المخزن المؤقت لتخفيف التضخيم لجعل محلول تيراميد Cy5 النشط. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول تريس كلوريد الصوديوم توين ثم أضف محلول تيراميد Cy5 النشط.
احتضان العينات لمدة 10 دقائق في الظلام. اغسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في الظلام. لتحضير كوكتيل الكشف عن EdU ، امزج المكونات.
قم بإزالة PBST ثم أضف كوكتيل الكشف عن EdU. احتضان العينة في الظلام لمدة 30 دقيقة. يغسل مع PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في الظلام.
لتلطيخ الحمض النووي ، قم بتخفيف Hoechst في PBST لتحضير محلول Hoechst. إزالة PBST ثم قم بإضافة حل Hoechst. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في الظلام.
اغسل العينات باستخدام PBST ثلاث إلى أربع مرات لمدة 10 دقائق في الظلام. بعد ذلك للتركيب ، قم بنقل medusae إلى البنك على زجاج الشريحة باستخدام ماصة نقل مع قطع الطرف. ضعي غطاء برفق على medusae بالملقط وأغلقي جانب الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
كشف الوسم المشترك لتعبير Nanos1 والخلايا الإيجابية EdU عن النمط المكاني للخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية والخلايا التكاثرية في المجسة. تم توزيع الخلايا الإيجابية EdU على نطاق أوسع في جميع أنحاء لمبة اللامسة ، في حين أن الخلايا الإيجابية Nanos1 المتراكمة محليا بشكل أكبر في لمبة اللامسة وموقع التفرع الجديد ، تشير إلى أنه يتم اكتشاف توزيعات متميزة للخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا المتكاثرة اعتمادا على توقيت النمو والمراحل المختلفة. لوحظ وضع العلامات المشتركة ل EdU و Nanos1 في 19.79٪ من الخلايا ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا هي مجموعة خلايا جذعية تتكاثر بنشاط.
ومن المثير للاهتمام ، تم العثور على 14.46٪ من الخلايا لتكون EdU إيجابية Nanos1 سلبية في منتصف المصباح وفي موقع التفرع الجديد ، مما يشير إلى وجود خلايا تكاثرية غير شبيهة بالجذعية. في المقابل ، لوحظ أن 26.32٪ من الخلايا إيجابية EdU Nanos1 سلبية في قاعدة المصباح وفي موقع التفرع الجديد ، مما يشير إلى وجود مجموعة من الخلايا الجذعية إما بطيئة الدورة أو هادئة ، ولا يتم اكتشاف أي منها عن طريق وضع علامات نبض EdU. يسمح وضع العلامات النبضية EdU مع وقت حضانة قصير باكتشاف الخلايا التكاثرية فقط بين الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا غير الشبيهة بالجذعية.
عند تغيير وقت حضانة EdU والجمع بين تجارب المطاردة طويلة الأمد ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية البطيئة أو أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك النسل والخلايا المتمايزة.
