يسمح هذا البروتوكول بتحليل الشغاف البدائي في اتجاه مستو. يمكننا تحليل توزيع خلايا الشغاف، وتباين الخواص للأوامر الزجرية الأخرى، ووصف شكل خلية شغاف واحدة أثناء نمو الصمام. بالمقارنة مع أقسام الأنسجة الكلاسيكية ، يسمح تصوير الوجه الداخلي لمنطقة تجديد الصمام الداخلي بتحليل قطبية الخلايا المستوية وديناميكيات خلايا الشغاف أثناء تطور الصمام في الأجنة السليمة.
يمكن استخدام هذه الطريقة لتعميق معرفة قطبية الخلايا المستوية أثناء تطور القلب. ابدأ بوضع الرحم المستأصل من الفئران الحامل الرحيمة في طبق بتري يحتوي على PBT المثلج. إزالة deciduye الفردية من الرحم تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط غرامة.
باستخدام ملاقط دقيقة ، قم بعمل شق في الجزء الأبيض من النفضي ، حيث يوجد الجنين. قم بإزالته برفق ، وتجنب السحب ، ونقل الأجنة إلى طبق بتري جديد مع PBT طازج باستخدام P-1000 مع قطع الطرف ، تاركا قطرا كبيرا بما يكفي لمرور الجنين دون أن ينكسر. للتنميط الجيني ، خذ قطعة صغيرة من كيس الصفار حوالي 0.5 ملليمتر مربع أو قطعة من الذيل من الطرف الخلفي ، عد خمسة إلى 10 سوميت باتجاه الرأس وهضمها في 100 ملليلتر من المخزن المؤقت المناسب.
تحت غطاء الدخان ، انقل الأجنة إلى الثلج البارد 4٪ PFA في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر عند أربع درجات مئوية. ثبت الأجنة من ساعتين إلى ليلة وضحاها عند أربع درجات مئوية على مغذي. تحت غطاء الدخان ، قم بإزالة مثبت 4٪ PFA من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة دون لمس الأجنة.
تخلص من PFA في حاوية مناسبة. اغسل الأجنة خمس مرات في PBT البارد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ملقط ناعم ، قم بإزالة القلب ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر مع PBT جديد.
استبدل PBT ب PBS Triton واغسل العينات ثلاث مرات ، خمس دقائق لكل منها ، في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. استبدل PBS Triton بمحلول مانع يحتوي على PBS Triton بمصل بقري معطل بالحرارة بنسبة 10٪. احتضان من ساعتين إلى ليلة وضحاها عند أربع درجات مئوية على شاكر المداري.
استبدل محلول الحجب بمحلول مانع يحتوي على جسم مضاد أولي بالتركيز المطلوب. احتضان بين عشية وضحاها على شاكر المداري عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، احتضان العينات لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري.
هذه الخطوة ضرورية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واحتفظ به عند أربع درجات مئوية ، حتى ثلاث تجارب مستقبلية. أضف أزيد الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ للحصول على أفضل حفظ.
ثم اغسل الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBS Triton لمدة ثلاث دقائق لكل منها. اغسل الأجنة باستخدام PBS Triton ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة واحتفظ بها على شاكر مداري عند أربع درجات مئوية. بعد الغسل الأخير ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الحجب الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي مترافق مضان ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية.
ثم أضف DAPI إلى المحلول واحتضان الأجنة طوال الليل على شاكر مداري عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية ، احتضان الأجنة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. هذه الخطوة ضرورية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
كرر خطوات غسل PBS Triton كما هو مذكور في مخطوطة النص. ضع القلوب على طبق بتري 35 ملم يحتوي على برنامج تلفزيوني. باستخدام سلك التنغستن والملقط الناعم ، اعزل القناة الأذينية البطينية أو قناة التدفق وقطعها طوليا.
قم بإعداد قسائم الغطاء ، والشرائح ، والملقط ، وماصة P-200 مع النصائح المناسبة ، ومنشفة ورقية ، وأي وسائط تثبيت مائية تعتمد على الجلسرين للتألق بدون DAPI. قم بلصق شريطين من الشريط على شريحة مفصولة ب 0.3 إلى 0.6 سم لإنشاء مساحة غرفة ثلاثية الأبعاد تسمح للعينات بالحفاظ على شكلها الأصلي دون سحقها. بعد ذلك ، باستخدام ما يقرب من 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، قم بإسقاط العينات بعناية على الشريحة بين شرائط الشريط باستخدام طرف ماصة P-200 مقطوع.
استخدم مجهر تشريح لزيادة الدقة. باستخدام ملقط دقيق ، ضع العينات بحيث يكون الشغاف متجها لأعلى وعضلة القلب لأسفل على الشريحة. قم بإزالة PBS الزائد بمنشفة ورقية وتجنب لمس العينة.
بعد ذلك ، جفف العينات لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لجعل العينات تلتصق بالشريحة. أضف 40 ميكرولترا من وسائط التركيب المائية إلى الأنسجة. ضع الغطاء على قطعتي الشريط وقم بخفضه ببطء على المنديل بإبرة أو ملقط.
تجنب خلق فقاعات الهواء. أغلق زلة الغطاء باستخدام قطرة واحدة من طلاء الأظافر على كل رأس من زلة الغطاء. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، نظف وسائط التثبيت الزائدة من جوانب زلة الغطاء باستخدام منشفة ورقية ماصة.
تجنب تحريك زلة الغطاء. أضف طلاء الأظافر على طول حواف الغطاء المنزلقة لإغلاقه بالكامل ، مما يمنع تبخر الوسائط المتصاعدة. باستخدام مجهر متحد البؤر عمودي أو مقلوب ، التقط صورا بتكبير 10X للعرض العام وعند 63X مع تكبير 3X للحصول على صور مفصلة.
تم تحليل شكل خلية الشغاف أثناء تكوين الصمامات بدقة خلوية. خلايا مفردة أو استنساخ عدد قليل من الخلايا عبرت عن GFP في الشغاف. كان تعبير GFP ودمجه مع توطين VE-cadherin تحت الخلوي نهجا فعالا لدراسة العلاقة بين ديناميكيات AJ وتكوين الفيلوبوديا وخلايا ما قبل EMT ، حيث طورت هذه الخلايا نتوءات غشائية مع ذوبان AJs.
أشارت الاختلافات في شدة تلطيخ VE-cadherin في الشغاف إلى وجود انقباض متباين الخواص في الشغاف الجنيني للقناة الأذينية البطينية في مراحل ما قبل الصمام. كان القلب كله ملطخا بالجسم المضاد VE-cadherin عند E8.5 و E9.5. في E8.5 ، يميل الشغاف في القناة الأذينية البطينية إلى أن يكون له تنظيم ظهاري مستقر ، ولم يتم اكتشاف الرؤوس التي شكلتها أكثر من أربع خلايا.
في E9.5 ، لوحظت رؤوس تصل إلى ست خلايا تشكل هياكل تشبه الوردة ، على غرار التنظيم الخلوي الموصوف سابقا في الظهارة التي تخضع لإعادة ترتيب الخلايا النشطة ، مما يشير إلى أن شغاف القناة الأذينية البطينية كان يخضع لإعادة ترتيب خلوي ديناميكي أثناء تطوير الصمام. منحنى التعلم ضروري لتصبح خبيرا في هذه التقنية. علاوة على ذلك ، يوصى بشدة باستخدام ملقط سيادي وسلك التنغستن.
اليوم ، اقتصر تصور الشغاف قبل الصمامات على المقاطع العرضية. يوفر نهجنا إمكانية دراسة سلوك الشغاف الصمامي الجنيني من وجهة نظر مستوية.
