هذا البروتوكول مفيد في العديد من الدراسات البيولوجية والسمية لنحل العسل المعالج بالمبيدات الحشرية. يساعد على اكتشاف الاستجابات الخلوية لأنسجة نحل العسل من المبيدات الحشرية المستخدمة في مستعمرات النحل لعلاج عث الفاروا. إنها أداة قوية للكشف عن التأثيرات الفرعية الصغيرة على الأنسجة مع سلوك النحل أو الحشرات المفيدة الأخرى.
للبدء ، خذ بعناية نحلة عاملة بالملقط وضعها على الثلج أو الفريزر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة دقيقتين لشل حركتها. ثبت النحلة على طبق بتري قطريا من خلال الجزء الخلفي العلوي من الصدر مرتين من اليسار إلى اليمين ومن اليمين إلى اليسار. ملحية حشرية فقيرة لتغطية الجسم.
ضع طبق بتري تحت المجهر المجسم ، وقم بالتركيز والضبط. لتشريح الأمعاء الوسطى ، ابدأ بالبطن عن طريق إدخال نقطة واحدة من المقص تحت tergite A5 في وسط الجانب الأيمن من جسم النحل. قطع إلى tergite A2. حافظ على الشفرة الداخلية للمقص موازية لجانب الجسم لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية.
اقلب المقص إلى اليسار وقطع. افتح الجزء الأيسر من البطن برفق وقم بتثبيته. باستخدام ملقط بيد واحدة ، اسحب معدة نحل العسل برفق لأعلى ، ومع مقص في اليد الأخرى ، قطع في نهاية المريء.
سحب المعدة والأمعاء الوسطى بعيدا عن البطن وقطع في المستقيم. استخدم ماصة بمحلول ملحي للحشرات وقم بإزالة أي براز أو أجزاء من الأنسجة. لتشريح الغدد البلعومية ، شل حركة نحلة عاملة على الجليد كما هو موضح من قبل.
اقطع الرأس وضعه على طبق أصغر بحيث يكون الهوائي متجها لأعلى. قم بتأمين الرأس بدبابيس ، أحدهما من خلال العين المركبة اليسرى والثاني من خلال العين المركبة اليمنى. قم بعمل قطع عبر العين المركبة الأولى على الجانب الداخلي من المسامير ، واستمر في الشفا ، ثم قم بعمل قطع آخر على الجانب الآخر عبر العين المركبة الثانية.
قطع الهوائيات. ارفع القناع واقطعه حيث لا يزال متصلا. خذ الملقط وقم بإزالة الغدد بعناية مع الدماغ وجزء من العيون المركبة.
لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين ، ضع الأقسام المنزوعة الشمع والمعاد ترطيبها في الهيماتوكسيلين لمدة خمس دقائق. ثم ضعها بعناية تحت ماء الصنبور الجاري لمدة دقيقتين. ثم ضعهم في ماء مقطر لمدة دقيقة واحدة ويوزين لمدة أربع دقائق.
ضع الشرائح 96٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة ثم 2-بروبانول لمدة دقيقتين ، وأخيرا في عامل المقاصة لمدة دقيقتين. أضف وسيط التثبيت وغطاء زجاجي واتركه يجف. مراقبة تحت المجهر الضوئي.
تحضير الجرار كوبلن. تحضير البروتيناز- K. بعد إزالة الشمع وإعادة ترطيب الأقسام ، ضع الشرائح في PBS لمدة خمس دقائق.
ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية وأضف البروتيناز-K. اغسل الشرائح بالماء المقطر. إخماد في البيروكسيديز الذاتية في درجة حرارة الغرفة.
شطف الشرائح مع PBS أو الماء. ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية وقم بتطبيق المخزن المؤقت للتوازن لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة. بعد المسح حول الأنسجة ، أضف إنزيم deoxynucleotidyl transferase الطرفي إلى كل قسم ، واحتضانه في غرفة مرطبة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
قبل الحضانة ، ضع مناشف ورقية مبللة داخل الدرج حول الشرائح وقم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي. بعد الحضانة ، ضع العينات على الرف واتركها في مخزن مؤقت للغسيل. بعد غسل الشرائح في PBS والمسح حول الأنسجة ، أضف قطرتين من بيروكسيديز المضاد للديجوكسيجينين الدافئ المتقارن إلى الأقسام واحتضانه لمدة 30 دقيقة في حاوية مرطبة.
بعد الغسيل في PBS ، قم بإعداد ركيزة بيروكسيديز قوة العمل ، وقم بتغطية الأقسام بركيزة البيروكسيديز ، وصمة عار لمدة خمس دقائق. ضع الشريحة تحت المجهر وحدد وقت التلوين الأمثل. بعد غسل الشرائح في رف تلطيخ والماء المقطر ، احتضان الشرائح في الماء المقطر لمدة خمس دقائق.
مكافحة وصمة عار باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين. اغسل الشرائح بوضعها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة ثلاث دقائق ثم في الماء المقطر. قم بتركيب الشرائح تحت زلات الغطاء الزجاجي ووسط التركيب واتركها مسطحة حتى تجف.
مراقبة تحت المجهر الضوئي. تم حساب النسبة المئوية للخلايا المصابة باستخدام المجهر الضوئي. أشارت النتائج إلى أن العلاج بحمض الأكساليك أثر بشكل كبير على الخلايا في الأمعاء الوسطى.
أظهر التلوين المناعي منتجات تفاعل حمراء أو بنية إيجابية في نوى موت الخلايا المبرمج للغدد البلعومية. تم تحديد منتج التفاعل الإيجابي بعد علاج إيميداكلوبريد أو كومافوس في غالبية الخلايا الغدية. عند رفع قناع رأس النحل ، احرص على عدم إتلاف أو سحب أجزاء الغدد البلعومية السفلية.
تكتشف هذه التقنية التغيرات تحت الإكلينيكية في النحل وهي مناسبة أيضا للكشف عن التأثيرات البيئية الأخرى على النحل وبعض الكائنات الحية الأخرى.
