جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon

يوفر إمالة مرحلة العينة طريقة بسيطة وقابلة للتعميم لزيادة توزيع اتجاه الجسيمات أثناء جمع بيانات cryo-EM أحادية الجسيم. يتيح التوزيع الموحد للجسيمات التي تم الحصول عليها بسبب إمالة مرحلة العينة تحسين جودة الخريطة الإجمالية وإمكانية تفسيرها. ابدأ بمحاذاة المجهر لضمان الإضاءة المتوازية للعينة وتقليل انحرافات الغيبوبة.

لتحديد المربعات المناسبة لجمع البيانات ، قم بتسجيل أطلس الشبكة بدون إمالة المرحلة أو مع إمالة المرحلة ، مما يوفر نظرة عامة على الجودة الإجمالية للشبكة وإشارة أولية إلى المناطق المناسبة لجمع البيانات. افحص المربعات يدويا عند التكبير المستخدم في عقدة اكتساب المربع. ابحث عن المربعات التي تكون فيها الرقاقة سليمة ، ولا تبدو مجففة ، ولها سمك جليدي مثالي ، وانقل مرحلة العينة إلى مربع الاهتمام.

حدد الارتفاع المركزي لموضع المسرح باستخدام متذبذب ألفا عند إمالة المسرح بزاوية 15 درجة تقريبا واضبط ارتفاع Z لإحضار المرحلة إلى ارتفاع مركزي باستخدام لوحة المفاتيح للمجهر. تأكد من أن إزاحة الصورة ضئيلة أثناء روتين تمايل ألفا. للعثور على ارتفاع Z أكثر دقة ، قم بتقديره في عقدة التركيز عند التكبير المستخدم في عقدة الاستحواذ المربعة.

اضبط إعدادات عقدة التركيز وقم بتمكين أو تعطيل خيار التركيز Z الدقيق أثناء قائمة الانتظار الأولية للمربعات. ثم اضغط على محاكاة. قم بإمالة مرحلة العينة إلى زاوية الميل المطلوبة لجمع البيانات عند الارتفاع المركزي الحقيقي وإعادة توسيط المرحلة إذا لزم الأمر.

اضغط على محاكاة في عقدة الاستحواذ المربعة لبدء وضع الأهداف في قائمة الانتظار لتعرض عقدة الاستحواذ بالكامل. بعد ذلك ، حدد هدف تركيز Z والمناطق ذات الثقوب المناسبة لتعرض التكبير العالي وأرسل الأهداف إلى قائمة الانتظار للتصوير. أعد مرحلة العينة إلى حالتها غير المائلة ثم انتقل إلى المربع التالي.

كرر هذه الخطوات حتى يتم وضع عدد كاف من التعرضات الكاملة في قائمة الانتظار. بمجرد وضع جميع المربعات في قائمة الانتظار ، انتقل إلى عقدة الاستهداف بأكملها واضغط على إرسال الأهداف في قائمة الانتظار. حدد السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة في إعدادات العقدة وافحص الأهداف المحددة يدويا بواسطة عقدة اكتساب التعرض عالي التكبير لاختبار ما إذا كان بإمكان مكتشف ثقب EM الآلي تحديد المناطق المناسبة للحصول على الصورة بدقة عند إمالة مرحلة العينة.

بمجرد أن يشعر المستخدم بالرضا عن دقة الاستهداف، قم بإلغاء تحديد الخيار السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة لجمع البيانات تلقائيا. يتم عرض الصور التمثيلية للشبكة عند التكبير المربع بزوايا إمالة مختلفة تم جمعها بالقرب من ارتفاع Z المركزي وبعيدا عنه. يشار إلى مركز الحزمة بمركز الحلقات الحمراء متحدة المركز ويشير السهم الأخضر إلى مربع الاهتمام.

هناك ميزة شبكة مكسورة مجاورة لمربع الاهتمام كمرجع. تظهر هنا تعريضات الثقب التمثيلية ومتوسطات فئة 2D التي تم جمعها بزوايا إمالة 0 درجة و 30 درجة و 60 درجة. على الرغم من أن تركيز البروتين لم يتغير عبر زوايا الميل المختلفة ، إلا أن زاوية الميل الأعلى تجعل المنطقة المصورة تبدو أكثر ازدحاما من حيث تركيز الجسيمات.

يتم عرض متوسطات فئة 2D المتأثرة بالاكتظاظ في هذا المربع الأحمر. تسمح بساطة البروتوكول لأي مستخدم قياسي للمجهر بتكييف استراتيجية جمع البيانات المائلة بسهولة.