يوضح هذا البروتوكول الاضطراب الميكانيكي لل elegans البحرية. في شكل بئر 96 مما يسمح بقياس كمي متوسط الإنتاجية للحمل البكتيري في الديدان الفردية. تزيد هذه التقنية من سرعة وتوحيد الاضطراب الميكانيكي مقارنة بالطرق القائمة على باسل مما يسمح للباحثين بإنتاج مجموعات بيانات أكبر بسهولة من قياسات الدودة المفردة عالية الجودة.
تتضمن هذه التقنية العديد من الأجزاء المتحركة ومن السهل أن تفقد مكانك. تأكد من إعداد جميع المواد والأنابيب الملصقة والمخازن المؤقتة والألواح قبل البدء. ستوضح ميغان تايلور ، وهي أخصائية أبحاث رائدة في مختبري.
ابدأ بإعادة تعليق عينة الدودة في ملليلتر واحد من M nine TX zero one في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. جمع الديدان البالغة عن طريق الطرد المركزي والتخلص من supernatant. باستخدام نفس معلمات الطرد المركزي.
شطف الديدان مرتين مع ملليلتر واحد من M9TX01 ومرة واحدة مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للدودة M9 ، لتقليل البكتيريا الخارجية. ثم ، أعد تعليق كل عينة في ملليلتر واحد من S المتوسطة بالإضافة إلى اثنين من الحرارة × قتلت OP50 في أنبوب استزراع. احتضن الأنابيب عند 25 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتمرير البكتيريا غير الملتصقة من الأمعاء.
بعد الحضانة ، اشطف الديدان المطهرة مرتين بملليلتر واحد من M9TX01 البارد وتخلص من الناتانت الفائق. ضع الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق لشل الديدان. ثم أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للدودة M nine الباردة مع مبيض غير معطر إلى كل أنبوب.
احتضن الأنابيب على الجليد لمدة لا تقل عن 10 دقائق لقتل البكتيريا الخارجية. تخلص من مخزن التبييض العازل وأعد الأنابيب إلى الجليد لمنع الديدان من الضخ. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من M9TX01 البارد إلى كل أنبوب وأجهزة طرد مركزي لمدة خمس ثوان.
في جهاز طرد مركزي صغير. أعد الأنابيب إلى الجليد وأزل السوبرناتانت. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
للنفاذية الكيميائية لبشرة الدودة. انقل الأنابيب التي تحتوي على الديدان في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى رف أنبوب درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول SDS / DTT إلى كل عينة دافئة.
احتضن الأنابيب لمدة تصل إلى ثماني دقائق على المقعد لتحطيم بشرة الديدان البالغة جزئيا. عند هذه النقطة ، سوف تموت الديدان وتستقر في قاع الأنبوب. بعد الحضانة ، تخلص بعناية من SDS / DTT supernatant.
ثم أضف ملليلتر واحد من M9TX01 إلى كل أنبوب وأجهزة طرد مركزي لفترة وجيزة لتكوير الديدان. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الديدان في مخزن مؤقت واحد من الديدان M تسعة ملليلتر مع 0.1٪ Triton x-100. للتحضير للاضطراب الميكانيكي للديدان ، احصل على صفيحة بئر معقمة بعمق ملليلتر 96 وغطاء لوحة سيليكون.
استخدم ملعقة مغرفة معقمة لإضافة كمية صغيرة من كربيد السيليكون المعقم 36 شبكة إلى كل بئر بحيث تغطي الشبكة بالكاد قاع البئر. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M nine إلى كل بئر. قم بتسمية الأعمدة والصفوف ثم قم بتغطية اللوحة بشكل فضفاض بغطاء لوحة السيليكون.
بعد ذلك ، انقل الديدان المتخلل إلى طبق بتري صغير مع M9TX01 مملوء حتى عمق سنتيمتر واحد. باستخدام ماصة مجهرية تشريحية تخرج الديدان الفردية في 20 حجم ميكرولتر وتنقلها إلى آبار فردية من صفيحة البئر 96 لإخراج أي ديدان عالقة في الماصة ، وشفط 20 ميكرولتر من M9TX01 من منطقة واضحة من طبق بتري وإطلاقها مرة أخرى في الطبق. بمجرد نقل جميع الديدان ، قم بتغطية لوحة البئر 96 بورقة من فيلم السقف المرن مع الجانب المدعوم بالورق الذي يواجه أسفل على آبار العينة.
ضع حصيرة السقف المصنوعة من السيليكون برفق فوق فيلم السقف المرن دون الضغط على الغطاء لأسفل في الآبار. ضع الطبق على أربع درجات مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة لمنع ارتفاع درجة الحرارة أثناء التعطيل. بعد تبريد اللوحة ، اضغط على حصيرة سقف السيليكون لأسفل بقوة في الآبار لإغلاقها.
ثم قم بتأمين اللوحات في اضطراب الأنسجة. رج الأطباق لمدة دقيقة واحدة عند 30 هرتز. ثم قم بتدوير الألواح بمقدار 180 درجة وكرر الاهتزاز لمدة دقيقة واحدة.
اضغط على الألواح بإحكام على المقعد مرتين أو ثلاث مرات لإزاحة أي حصى من فيلم السقف المرن. جهاز الطرد المركزي مجموعة لوحة 2،400 مرات G لمدة دقيقتين لجمع العينات في الجزء السفلي من الآبار. ثم قم بإزالة غطاء السيليكون واسحب فيلم السقف.
لإعداد عشرة أضعاف التخفيف التسلسلي لهضمات الدودة ، املأ 180 ميكرولتر من واحد X PBS في الصفوف من B إلى D من لوحة بئر 96. باستخدام ماصة متعددة الآبار مضبوطة على 200 ميكرولتر ، امزج ببطء هضم الدودة عن طريق السحب. انقل الحد الأقصى لكمية السائل إلى الصف A من لوحة البئر 96 التي تحتوي على PBS.
باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة 20 ميكرولتر من الصف العلوي وقم بتوزيعها في الصف B.Followed بالخلط. كرر هذه الخطوة للصف B إلى C ثم الصف C إلى D للحصول على تخفيف 1000 مرة للقياس الكمي البكتيري للديدان أحادية المستعمرة. لوحة 10 إلى 20 ميكرولتر من كل تخفيف على لوحات أجار الصلبة.
بالنسبة للاستعمار متعدد الأنواع ، قم بلوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار 10 سم. باستخدام هذا البروتوكول ، لوحظ التعقيم الخارجي الفعال بعد التبييض السطحي للديدان المشلولة الباردة كما يتضح من انخفاض البكتيريا الخارجية في المخزن المؤقت. دون التأثير على البكتيريا المرتبطة بالأمعاء.
أدى التعطيل اليدوي للديدان إلى مزيد من عدم التجانس. كانت حصى كربيد السيليكون مثالية للتعطيل مع أو بدون Tri Andex. في طريقة البئر 96 ، لم تكن الخرز الزجاجي الكبير مناسبا لتقنية البئر 96.
أنتجت الخرز الزجاجي الصغير نتائج متسقة ولكنها انسد الأنبوب عند الطرف. أظهرت الديدان المستعمرة على نفس المجموعة من البكتيريا تباينا كبيرا في الحمل المعوي عند ملاحظتها للبكتيريا الفردية والمجتمعات البكتيرية متعددة الأنواع. أظهرت الديدان المستعمرة بالبكتيريا التي تعبر عن GFP عدم التجانس في قياسات الدودة الفردية.
لهذا GFP التعبير عن سلالة بكتيرية مقارنة استعمار النوع البري بريستول لين اثنين من الديدان. بالنسبة ل DAF ، أظهر اثنان من طفرات IGF أن متحور DAF 16 يدعم مجموعات أكبر من البكتيريا ، في حين أن DAF Two مقاوم للاستعمار. كان هذا التباين مميزا ومتسقا على مدى مراحل مختلفة من نفس التجربة.
ووجد أن إعادة أخذ عينات من البيانات لمحاكاة هضمات الدفعات يغير التوزيع مقارنة ببيانات الدودة الفردية. تركزت الدفعة المستنبطة CFU لكل دودة حول المتوسط الحسابي للبيانات الفردية مما أدى إلى فقدان التباين البيولوجي. بدلا من الشروع في هضم التبييض السطحي الحي وشطف الديدان يمكن استخدامها لمزيد من التجارب.
ستستأنف الحركة بسرعة بمجرد إزالة الديدان من البرد.
