يقدم بروتوكولنا تقدما كبيرا في تصنيع المواد الهلامية النانوية المحملة بالبروتين بحجم 100 نانومتر في تقنية الربط المتقاطع والبلمرة المشتركة بخطوة واحدة في ظل ظروف تفاعل مائي معتدلة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتها على تصنيع الهلاميات النانوية المحملة بالبروتين في ظل ظروف معتدلة ، وتجنب المذيبات العضوية القاسية ودرجات الحرارة المرتفعة ، وبالتالي الحفاظ على سلامة الحمولة البيولوجية. ابدأ بغسل الأواني الزجاجية بالماء منزوع الأيونات المصفى.
لتجفيف الأواني الزجاجية ، قم بتوصيل فوهة آمنة بمخرج الهواء المضغوط الموجود على جانب غطاء الدخان. أمسك القارورة بإحكام ، ضع الفوهة بالداخل وقم بتنشيط الهواء المضغوط لإصدار تيار متحكم فيه. بعد ذلك ، املأ قارورة زجاجية سعة 10 ملليلتر بالماء منزوع الأيونات وأغلقها بحاجز مطاطي.
لإزالة الأكسجين من الماء ، املأ بالونا بغاز النيتروجين وقم بتوصيل إبرة بالبالون. ضعه على الحاجز واثقب الحاجز المطاطي للسماح بتدفق النيتروجين. أيضا ، قم بتوصيل إبرة خروج بالقارورة للحفاظ على تدفق ثابت للنيتروجين.
بعد ذلك ، قم بإذابة BSA أو BSA الموسوم ب Cy7 في ماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين. ثم أضف هذا المحلول إلى قارورة زجاجية نظيفة سعة 10 ملليلتر. أضف محلول AETC إلى القارورة وأغلقها بحاجز مطاطي آخر.
قم بإذابة مادة الأكريلاميد والماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين وأضف هذا المحلول إلى خليط القارورة. ثم قم بإذابة الرابط المتقاطع لثاني كبريتيد في ماء منزوع الأيونات وأضفه إلى الخليط في القارورة. اغسل الخليط بغاز النيتروجين لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بإذابة SDS في الماء منزوع الأيونات منزوع الأكسجين. باستخدام حقنة مغسولة بغاز النيتروجين ، أدخلها في الخليط. بعد ذلك ، أضف TEMED إلى خليط التفاعل.
دع الخليط يتخلص من الأكسجين لمدة ثلاث دقائق تحت تدفق مستمر لغاز النيتروجين. قم بإذابة بيرسلفات الأمونيوم في مليلتر واحد من الماء منزوع الأكسجين منزوع الأيونات وإدخاله في خليط التفاعل. ثم أغلق القارورة تحت جو من النيتروجين وحرك الخليط لمدة ثلاث ساعات و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
لإنهاء التفاعل ، قم بإزالة الختم من القارورة. ينتهي التفاعل بمجرد أن يصبح الخليط صافيا وعديم اللون. لتنقية المواد الهلامية النانوية ، أضف خليط التفاعل إلى وحدة مرشح الطرد المركزي سعة 15 ملليلترا.
املأ الوحدة بالماء منزوع الأيونات وأجهزة الطرد المركزي لإزالة المواد الكيميائية غير التفاعلية أو الحمولة الصافية غير المغلفة. أضف ملليلترين من الماء منزوع الأيونات في وحدة الطرد المركزي لتخفيف عينة الهلام النانوي. قم بتخزين العينة النهائية عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمنع تحلل البروتين المغلف.
خذ كوفيت أو خلية شعرية مطوية يمكن التخلص منها لتحليلها. قم بتنظيفه بالماء منزوع الأيونات ، متبوعا بنفخ الهواء المضغوط لإزالة أي جزيئات غبار كبيرة. ثم املأ الكوفيت ب 50 إلى 100 ميكرولتر من العينة ، مع تخفيفها ب 750 إلى 1،000 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات المصفى.
لإدخال الكوفيت في أداة DLS ، افتح غطاء حجرة العينة وأمسك الكوفيت من حوافها العلوية لتجنب ترك بصمات الأصابع للنوافذ البصرية. ضع الكوفيت محاذاة بشكل صحيح مع المسار البصري للجهاز. ثم أغلق حجرة العينة لحجب الإضاءة المحيطة.
ابدأ قياس حجم الجسيمات باستخدام البرنامج ذي الصلة على جهاز DLS. بعد القياس، حدد النتائج ذات الصلة بالعينة، بما في ذلك متوسط Z ومتوسط PI ومعدل العد في الدقيقة وإمكانات زيتا والرسومات ذات الصلة. تأكد من أن دالة الارتباط تعرض منحنى سيني سلس يدل على عينة موحدة.
بمجرد اكتمال التحليل ، قم بإزالة الكوفيت بعناية من أداة DLS. لوحظ انخفاض تدريجي في شدة الذروة المرتبطة ببروتين BSA ، مما يشير إلى تغليف البروتين داخل بنية النانوهلام. أظهر التوصيف الكيميائي الفيزيائي للهلاميات النانوية المحملة بعلامة Cy7 الذروة المحددة عند 50 إلى 100 نانومتر.
ومع ذلك ، أظهرت الهلاميات النانوية الفارغة أحجاما غير متسقة وأكبر. تم إصدار ما يصل إلى 86٪ من BSA المغلف بعلامة Cy7 في غضون 48 ساعة. من ناحية أخرى ، أدت تجارب التحكم بدون إضافة الجلوتاثيون فقط إلى إطلاق 15٪ من البروتين.
أظهر تحليل الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه أن BSA المعزول أثناء تخليق النانو هلام وحضانة ما بعد الجلوتاثيون احتفظ بهيكله ، المشار إليه بالذروة عند 1 ، 662 سم معكوسة تمثل منعطفات بيتا السليمة. ومع ذلك ، أظهر BSA من المواد الهلامية النانوية المخزنة لمدة 30 يوما ذروة عند 1،613 سم معكوسا ، مما يدل على هياكل صفائح بيتا بين الجزيئات وتجميع البروتين. أظهر ثنائي اللون الدائري أطياف غير متغيرة مثل BSA الأصلي ، مما يشير إلى الحفاظ على بنية ألفا الحلزونية.
ومع ذلك ، فإن الانحرافات الطفيفة في القمم المميزة ل BSA المعزولة بعد 30 يوما تشير إلى بعض التجميع. يعد الحفاظ على تدفق مستمر للنيتروجين أمرا بالغ الأهمية لمنع الأكسجين من تثبيط بلمرة الجذور الحرة. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب مكونات نظام البدء إضافة سريعة لتوليف ناجح.
بعد هذا الإجراء ، يمكن توصيف حركية التوزيع والتشكل وإطلاق الحمولة بحجم الهلام النانوي من خلال تقييم استجابة DLS و TEM والأكسدة والاختزال عن طريق الحضانة باستخدام عامل الاختزال الفسيولوجي الجلوتاثيون.
