تنتج المستقلبات التي تطلقها ميكروبات الأمعاء تأثيرات معقدة على المضيف. يقدم هذا البروتوكول طريقة لاستجواب دور مستقلبات الأمعاء في دماغ الفأر وسلوكه. توفر هذه التقنية طريقة دقيقة ودقيقة ومعتمدة لتوصيل مستقلبات الأمعاء إلى الدماغ في الفئران التي تتحرك بحرية.
نحن نقدم أفضل منهجية شاملة وفسيولوجية للحصول على نظرة ثاقبة في أبحاث محور الدماغ المعوي. ضع الماوس على الإطار المجسم، وقم بتثبيت قواطع الماوس على شريط القواطع في حامل القواطع المجسمة. قم بتغطية الأنف بقناع مخروط الأنف.
ثم قم بتقييم الإحساس بألم الماوس عبر منعكس القرصة العلوي ، وتأكد من معدل تنفس ثابت قبل شق الموقع الجراحي. بمجرد إزالة الفراء المشذب على الرأس بواسطة الشريط اللاصق ، قم بحقن الكيتوبروفين المسكن تحت الجلد لتخفيف الألم وتطبيق مرهم العين. بعد ذلك ، قم بإصلاح الرأس عن طريق إدخال شريط الأذن المدبب في قناة الأذن.
شد مشبك الأنف على حامل القواطع واضغط على الرأس بلطف لضمان تثبيت الرأس. استخدم 3 مقشرات بالتناوب من مسحة الكلورهيكسيدين لتطهير فروة الرأس. الآن ، استخدم مشرط تشريح لإجراء شق أقل من سنتيمتر واحد في فروة الرأس بطريقة خلفية أمامية.
بعد فتح الشق ، امسح الجمجمة بقطعة قطن تمسك بها ملقط تشريح صغير. استنادا إلى الإحداثيات المجسمة، حدد وسم موضع البطين الجانبي الأيمن كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، قم بحفر ثقب عبر الجمجمة في الموقع المسمى باستخدام مثقاب مجسمة ، وبعد ذلك ، حفر ثقبين إلى أربعة ثقوب أخرى في الجمجمة.
امسح الجمجمة بقطعة قطن ليدوكائين وقم بتركيب 2 إلى 4 مسامير غير قابلة للصدأ على الثقوب. ضع قنية الدليل التجاري على حامل القنية المجسمة وقم بتطهيرها باستخدام معقم السرعة الزجاجية عند 150 درجة مئوية. ثم حرك حامل القنية المجسمة إلى الحفرة المحفورة للبطين الجانبي وأدخل ببطء قنية التوجيه التجاري في الحفرة حتى يتم تحقيق العمق المطلوب.
الآن قم بتطبيق 10 ميكرولتر من لاصق n-Butyl cyanoacrylate لإصلاح قنية الدليل التجاري في الحفرة المحفورة وانتظر لمدة 3 إلى 4 دقائق. حرر قنية الدليل التجاري بلطف من حامل القنية المجسمة وقم بتطبيق أكريليك الأسنان على فروة الرأس المحفورة لإصلاح قنية الدليل التجاري وانتظر لمدة 5 دقائق على الأقل. زرع الدمية التجارية في قنية الدليل التجاري.
ثم ضع الماوس في قفص جديد مع وسادة تدفئة تحته للتعافي من التخدير وراقب باستمرار حتى يستيقظ الماوس تماما. قم بتركيب حقنة الميكرولتر ، التي تحتوي على 10 ميكرولترات من الماء المقطر ، على مضخة الحقن المجهري. باستخدام حقنة الأنسولين ، املأ أنبوب البولي إيثيلين بالماء المقطر وقم بتوصيل حقنة الميكرولتر بأنبوب البولي إيثيلين المعلق.
قم بتشغيل وحدة التحكم في الحقن المجهري واضغط على عرض جميع القنوات للوصول إلى شاشة الأوامر. بعد ذلك ، اضغط على التكوين وحدد هدف الحجم إلى 9،800 نانولتر بمعدل تسليم 100 نانولتر في الثانية. ثم اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع النفخ واضغط على Run لبث 9،800 نانولتر من الماء المقطر من أنبوب البولي إيثيلين المتصل بحقنة الميكرولتر.
الآن ، ضع الحاقن في قارورة تحتوي على الزيت المعدني ، واضغط على التكوين واضبط هدف الحجم على 3000 نانولتر مع معدل توصيل إلى 100 نانولتر في الثانية. لسحب 3000 نانولتر من الزيوت المعدنية ، اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب ثم اضغط على تشغيل. قم بتفكيك أنبوب البولي إيثيلين من إبرة حقنة الميكرولتر.
لبصق 3000 نانولتر من الماء المقطر من إبرة حقنة الميكرولتر، اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع النفخ واضغط على تشغيل. ثم أدخل حقنة الميكرولتر مرة أخرى في أنبوب البولي إيثيلين. ضع الحاقن في قارورة تحتوي على SCFAs.
اضغط على التكوين وحدد هدف الحجم إلى 9،500 نانولتر مع معدل التسليم إلى 100 نانولتر في الثانية. اسحب 9،500 نانولتر من SCFAs عن طريق الضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع السحب والضغط على تشغيل. قم بتسمية مرحلة SCFAs النفطية للتحقق مما إذا كان قد تم غرس SCFAs بنجاح.
اضغط على التكوين واضبط هدف الحجم المطلوب بمعدل تسليم إلى 7 نانولتر في الثانية. اضغط على الاتجاه للتبديل إلى وضع infuse. اضغط على زر التشغيل لبث حقنة الميكرولتر إلى الأمام حتى يخرج السائل في الطرف الأمامي من الحاقن التجاري قبل إدخال الحاقن في القنية لحقن SCFAs.
بعد تخدير الفأر ، أدخل الحاقن التجاري في قنية الدليل التجاري. بمجرد تعافي الفأر من التخدير ، ضعه في قفص جديد واسمح له بالاستكشاف لمدة 35 دقيقة بحرية. غرس SCFAs باستخدام معدل توصيل 7 نانولتر في الثانية لحجم مستهدف من 2،100 نانولتر في أول 5 دقائق.
ثم اضغط على الاتجاه إلى وضع infuse واضغط على تشغيل. بعد الاختبار السلوكي ، قم بإزالة الحاقن التجاري من قنية الدليل التجاري. غرس 2،100 نانولتر من المقتفي المحايد بمعدل تسليم 7 نانولتر في الثانية للتحقق من موقع التسريب.
قم بتصوير إشارة الفلورسنت في موقع التسريب باستخدام مجهر التألق. سافرت كل من الفئران المشبعة ب ACSF و SCFAs في قفص جديد لمدة 35 دقيقة. لم يلاحظ أي فرق في النشاط الحركي في القفص الجديد بين ضخ SCFAs و ACSF.
تم اكتشاف صبغة الفلورسنت في البطين الجانبي والمناطق المحيطة به من دماغ الفأر عند غرسها مع قنية دليل تجاري. وبالمثل ، يؤدي التسريب من خلال قنية دليل الفولاذ المقاوم للصدأ إلى اكتشاف الإشارات في البطين الجانبي والمناطق المحيطة به من دماغ الفأر. إن الجمع بين هذا الإجراء والتقنيات العصبية القائمة على الدائرة سيسمح للعلماء باكتساب نظرة ثاقبة على التحكم القائم على الدائرة في الدماغ والسلوك الذي تساهم به مستقلبات الأمعاء.
تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف دور الميكروبات والمستقلبات في محور الدماغ المعقد للأمعاء.
