يمكن أن يحدد هذا البروتوكول ما إذا كانت الأمعاء والغدد الدرقية تعيق انتشار الفيروس ويمكن أن يساعد في تقييم مخاطر الفيروسات التي ينقلها البعوض والتي تنتقل عن طريق الزاعجة المصرية. تضمن بروتوكولنا طريقتين للعدوى ، التغذية الفموية والحقن داخل الصدر ، والتي يمكن أن تقيم بشكل فعال كفاءة ناقل الفيروس المفصلي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على حالات عدوى إضافية بالفيروسات المنقولة بالمفصليات في مجموعة متنوعة من ناقلات البعوض، مثل عدوى فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في الزاعجة، ويمكن أن يثبت أنه إجراء عملي.
سيوضح الإجراء فاي وانغ ، مساعد باحث من مختبري. لأداء التغذية الاصطناعية باستخدام نظام تغذية البعوض الاصطناعي ، قم بقطع أغشية الكولاجين إلى الحجم المناسب ، وقم بتثبيتها في الخزانات باستخدام الحلقات O. أضف ثلاثة ملليلتر من خليط الفيروس والدم إلى الخزانات ، وأغلق الخزانات باستخدام سدادات بلاستيكية لمنع التسرب.
ضع الأكواب البلاستيكية التي تحتوي على البعوض في صندوق القفازات. قم بربط الخزانات المختومة في وحدة التغذية FU1 ، وضع خزانا واحدا على كوب واحد. قم بتشغيل وحدة الطاقة ، وإطعام البعوض لمدة ساعة واحدة.
بعد الرضاعة ، قم بتخدير البعوض بالثلج لعدة ثوان حتى يغمى عليه. صب البعوض المخدر في طبق بتري وضعت على الجليد ، وتغطية الغطاء بسرعة. اختر أنثى البعوض المحتقن بالملقط ، وانقلها إلى أكواب بلاستيكية جديدة بمعدل 50 أنثى بعوضة لكل كوب.
لف الكأس بشبكة ناموسية مقطوعة ، وقم بتغطيتها بغطاء به فتحة في المنتصف. قطع الاسفنجة إلى قطع صغيرة ، ووضعها على الكؤوس. أضف 8٪ محلول جلوكوز على الإسفنجة باستخدام قطارة بلاستيكية يمكن التخلص منها.
ضع الأكواب التي تحتوي على إناث البعوض في الحاضنة عند 27 درجة مئوية عند رطوبة 80٪ لمدة 10 أيام. استبدل إسفنجة جديدة مشبعة بالجلوكوز كل 72 ساعة. للتلقيح داخل الصدر ، قم بإعداد البعوض الأنثوي كما هو موضح في مخطوطة النص.
لتحضير تخفيف الفيروس المعدي ، قم بإزالة مخزون الفيروس من الفريزر 80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد. قم بتخفيف مخزون الفيروسات عند تخفيف فيروس 100 نانولتر يحتوي على 100 إلى 500 وحدة من وحدات تكوين البلاك مع وسيط RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. ضع تخفيف الفيروس على الثلج.
بعد ذلك ، قم بإعداد إبر الحقن المجهري باستخدام Puller 1000 مع تعيين المعلمات في برنامج مجتذب الإبرة كمؤشر حرارة إلى 450 ، والقوة في g إلى 110 ، والمسافة بالمليمتر إلى واحد ، والتأخير في ثوان إلى الصفر. قطع طرف إبرة مسحوبة مع ملاقط تحت المجهر تشريح في تكبير 16x. ردم الإبرة بالزيت المعدني من خلال حقنة معقمة يمكن التخلص منها.
قم بتوصيل الإبرة في الحاقن باتباع التعليمات الموجودة على الجهاز. أدخل الإبرة بعناية في أنبوب يحتوي على تخفيف الفيروس المعدي. ثم اضغط على زر التعبئة لملء ما يقرب من أربعة ميكرولترات من تخفيف الفيروس في الإبرة.
بمجرد ملء الإبرة ، لا تلمس الإبرة أو تتلفها. اختر ما يقرب من 50 أنثى من البعوض المخدر بملاقط ، وضعها على طبق ثلج. ضع اللوحة تحت الحاقن ، وأدخل الإبرة في التجويف الصدري للبعوض تحت مجهر تشريح.
اضبط حجم الحقن على 100 نانولتر والمعدل على 50 نانولتر في الثانية. اضغط على زر الحقن للسماح لمحلول الفيروس بالتدفق إلى البعوض. عند الحقن الناجح ، ينتفخ البطن قليلا.
ضع البعوض المصاب في كوب بلاستيكي جديد يوضع على الثلج. عندما يكون عدد البعوض المصاب كافيا ، لف الكوب بشبكة ناموسية مقطوعة وقم بتغطيتها بالغطاء. لجمع اللعاب من أنثى البعوض المصابة ، صب البعوض المخدر في طبق بتري يوضع على الجليد ، وأغلق الغطاء بسرعة.
ضع أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر مملوءة بزيت الغمر جنبا إلى جنب على الطين المطاطي. اختيار البعوض الإناث مع ملاقط ، ووضعها على طبق الجليد. إزالة أرجلهم وأجنحتهم مع ملاقط.
ضع جزء فم بعوضة واحدة على كل طرف ماصة لجمع اللعاب كما يفرزه البعوض في الزيت في درجة حرارة الغرفة. بعد 45 إلى 60 دقيقة ، ضع أطراف الماصة في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 200 ميكرولتر من الوسط المخفف للفيروس. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 5،000 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لطرد اللعاب في الأنابيب.
قم بتخزين الأنابيب المحتوية على اللعاب عند 80 درجة مئوية لتحديد معدلات الإرسال لاحقا. بعد جمع اللعاب ، تشريح البعوض الإناث المصابة. باستخدام الملقط ، قم بقطع رؤوس البعوض ، وضع كل رأس في أنبوب فردي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط RPMI 1640.
الاستيلاء على الصدر مع ملقط. ثم ، أمسك الجزء قبل الأخير من البطن بملقط آخر ، واسحب القناة الهضمية للخارج. نظف القناة الهضمية بحثا عن أي أنسجة وأعضاء طائشة.
اغسل القناة الهضمية باستخدام برنامج تلفزيوني ، وضع كل أمعاء في أنبوب فردي يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط RPMI 1640. قم بتخزين هذه الأنابيب عند 80 درجة مئوية لتحديد معدل انتشار الفيروس والعدوى لاحقا. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تحديد الحمض النووي الريبي الفيروسي في الأمعاء والرأس واللعاب لإناث البعوض في 10 أيام بعد الإصابة.
كان عيار فيروس بحيرة إبينور في أمعاء ورؤوس ولعاب البعوض الملقح داخل الصدر أعلى من البعوض المصاب عن طريق الفم. وبلغ معدل العدوى والانتشار للبعوض الملقح داخل الصدر 100 في المائة، ووجد أن معدل العدوى للبعوض المصاب عن طريق الفم كان 70 في المائة و 38.1 في المائة على التوالي. وصل معدل انتقال البعوض الملقح داخل الصدر إلى 90٪ ولكن بالنسبة للبعوض المصاب عن طريق الفم كان 4.8٪ فقط تم اختيار إناث البعوض المحتقن للحفاظ على الاتساق ، حيث تؤثر كمية التغذية على المحتوى الفيروسي.
