تمكن هذه الطريقة الباحثين من التحقيق بشكل منهجي في كيفية تأثير إشارات المصفوفة على النمط الظاهري للخلايا في ثقافة 3D. نحن نوضح الإجراء باستخدام ثقافات خلايا GBM. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التنفيذ عالي الإنتاجية ، والذي يسمح لنا بفحص العديد من ظروف المصفوفة.
يمكن استخدام هذه التقنية لتطوير مصفوفات محاكاة الأنسجة التي تحافظ على وظائف محددة في نماذج زراعة الخلايا ، مثل مقاومة الخلايا السرطانية للأدوية ، وربما تحديد علاجات جديدة. ستوضح ماري إبرسون وكيلي تامورا ، الباحثتان الجامعيتان من مختبر سيدليتس ، الإجراء ، بدءا من إعداد محلول مخزن مؤقتا ب HEPES عن طريق إذابة مسحوق HEPES عند 20 ملليمولار في محلول الملح المتوازن Hanks.
اضبط الرقم الهيدروجيني إلى سبعة بعد التفاقم الكامل. في المحلول المخزن مؤقتا ب HEPES ، قم بإذابة HA المعزول بحيث يتم تعديل 6 إلى 8٪ من بقايا حمض الكربوكسيل على كل حمض جلوكورونيك باستخدام ثيول بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر في محلول عازل. يحرك المزيج في أقل من 1000 دورة في الدقيقة باستخدام لوحة تحريك مغناطيسية في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما، وعادة ما يكون حوالي 45 دقيقة.
أثناء ذوبان HA ، قم بإعداد محاليل منفصلة من 100 ملليغرام لكل ملليلتر من 8arm PEG norbornene ، و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من ثيول PEG 4arm ، وأربعة ملليمولات من الببتيد المحتوي على السيستين أو السيستين ، وأربعة ملليغرام لكل ملليلتر من LAP في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. قم بإعداد محاليل أربعة ملليمولات من جميع الببتيدات ليتم ربطها داخل هيدروجيل واحد في هذه المرحلة. امزج المحاليل الفردية من HA و PEG norbornene و PEG thiol والببتيدات المحتوية على السيستين ثيول لتحقيق التركيزات النهائية لمصفوفات الهيدروجيل النهائية.
يحرك المزيج بأقل من 1000 دورة في الدقيقة على صفيحة درج مغناطيسية لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى يمتزج تماما. قم بمحاذاة العينات مع جهاز الإضاءة مع كل مصباح LED آخر في عمود واحد من قوالب السيليكون أو لوحة 384 بئرا. افتح معلمات UV LED وأدخل قيما للكثافة والإضاءة.
ثم انقر فوق إنهاء لبدء الإضاءة. بعد الإضاءة ، عند وضعها في زاوية واحدة ، حرك لوحة البئر إلى الزاوية التالية وكررها. لإضاءة الآبار على النصف الآخر من اللوحة ، ارفع اللوحة خارج الحامل وقم بتدوير 180 درجة.
لتوليد هيدروجيل بميكانيكا مختلفة ، ابدأ بتنظيف الشرائح الزجاجية وقوالب السيليكون باستخدام شريط لإزالة الحطام. قم بلصق قوالب السيليكون بالشريحة الزجاجية ، واضغط لأسفل لضمان ختم جيد ، وإزاحة أي فقاعات هواء. بعد ذلك ، ماصة 80 ميكرولتر من محلول سلائف الهيدروجيل في كل قالب سيليكون على الشريحة الزجاجية.
ضع الشريحة الزجاجية على جهاز الإضاءة المحاذي لكل مؤشر LED آخر في عمود واحد. قم بتعريض سلائف الهيدروجيل للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية للوصلة المتقاطعة للصور. بمجرد توقف الإضاءة ، استرجع الشرائح وقم بفك المواد الهلامية من القوالب عن طريق تتبع المحيط الداخلي للقالب بطرف رفيع.
إزالة قوالب السيليكون مع ملاقط أو ملقط. املأ صفيحة من 12 بئرا بملليلترين من DPBS. انقل الهلاميات المائية المتقاطعة إلى صفيحة بئر فردية عن طريق ترطيب ملعقة ودفعها برفق بعيدا عن الشريحة الزجاجية.
تحضير الخلايا المطلوبة كمحلول أحادي الخلية. اجمع كرويات الورم الأرومي الدبقي، التي يبلغ قطرها حوالي 150 ميكرومتر، من مزرعة تعليق قارورة T-75 إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. شطف قارورة الثقافة مع خمسة ملليلتر من DPBS لإزالة أي خلايا متبقية والوسائط وإضافة هذا الحجم إلى أنبوب مخروطي.
جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خلايا عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية وإعادة تعليقها في خمسة ملليلترات من DPBS. جهاز طرد مركزي بسرعة 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا.
استنشاق السوبرناتانت باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية ، ثم إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر من كاشف تفكك الخلايا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. أضف ثلاثة ملليلترات من الوسط الكامل وماصة بلطف ثلاث إلى خمس مرات لتحطيم الكرويات إلى تعليق أحادي الخلية.
قم بالطرد المركزي لنظام التعليق أحادي الخلية بسرعة 400 مرة G لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا في درجة حرارة الغرفة. استنشاق supernatant مع ماصة مصلية خمسة ملليلتر ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الكامل.
قم بإزالة جزء من الخلايا للعد باستخدام مقياس الدم. قم بتخفيف هذا الجزء مرتين باستخدام أزرق التربان ، الذي يتخلل الخلايا ذات الجدوى المعرضة للخطر. عد فقط الخلايا الحية عديمة اللون.
تحديد عدد الخلايا اللازمة للتغليف. انقل كمية من الوسائط التي تحتوي على إجمالي عدد الخلايا اللازمة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.7 ملليلتر. تدور لأسفل عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
استنشاق supernatant مع micromatete ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلايا في محلول سلائف الهيدروجيل ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة ميكروماصة 1000 ميكرولتر أربع إلى خمس مرات. قم بتحميل الخلايا في جهاز سحب متكرر لتوزيع 10 ميكرولترات.
لتجنب الفقاعات والتوزيع غير المتكافئ ، قم بتعبئة جهاز السحب المتكرر عن طريق توزيع مرة أو مرتين إضافيتين في حاوية نفايات. في كل بئر من صفيحة 384 بئرا ، قم بتوزيع 10 ميكرولترات من الخلايا المعلقة في محلول هيدروجيل من جهاز السحب المتكرر. باستخدام صفيف LED ، قم بإضاءة كل خلية تحتوي على بئر لمدة 15 ثانية لتحقيق الخصائص الميكانيكية المطلوبة.
أضف 40 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى كل بئر يحتوي على الخلايا. أضف 50 ميكرولتر من DPBS إلى الآبار الجافة غير التجريبية المحيطة بالمواد الهلامية لتقليل الخسائر الناجمة عن التبخر. بالنسبة لخلايا الورم الأرومي الدبقي ، أضف 40 ميكرولترا من الدواء المحتوي على الوسائط لتحقيق التركيز النهائي المطلوب ، بدءا من ثلاثة أيام بعد التغليف.
أضف 10 ميكرولترات من كاشف CCK8 إلى كل بئر يحتوي على الخلايا. احتضان لمدة ساعة إلى أربع ساعات ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر لجميع الآبار بعد الحضانة.
أظهر استجواب AFM للمناطق ذات المقياس الميكروني على أسطح الهلاميات المائية المفردة أن الهلاميات المائية ذات المتوسط الأكثر ليونة من وحدات يونغ لديها أيضا نطاقات أصغر من المودولي من الهلاميات المائية الأكثر صلابة. أظهرت الثقافات ثلاثية الأبعاد لخلايا GS122 المبذرة بكثافات 2،500،000 خلية لكل ملليلتر جدوى أعلى بكثير عند تقييمها بعد سبعة أيام في الثقافة مقارنة بتلك البذرة بكثافات 500،000 خلية لكل ملليلتر. أظهرت خلايا GS122 مكاسب البقاء على قيد الحياة في حالة الكيلو باسكال الثمانية عندما تم تضمين الببتيدات المشتقة من أوستيوبونتين في المصفوفة ، في حين أن دمج الببتيدات السيالوبروتين المرتبطة بالتكامل أو الببتيدات المشتقة من تيناسين سي وفر الحد الأدنى من فوائد البقاء على قيد الحياة ، مثل الثقافة والمصفوفات مع ببتيد الزنجبيل RGD.
وعلى النقيض من ذلك، لم تمنح أي ببتيدات مكاسب للبقاء على قيد الحياة في حالة زراعة الكيلوباسكال البالغة 0.8 كيلوباسكال. تنتشر كل من خلايا GS122 و GS304 عند زراعتها في مصفوفات هيدروجيل ناعمة أو قاسية ، بما في ذلك الببتيدات المحتوية على RGD. تظهر خلايا GS122 نقصا مماثلا في الانتشار في كل من 0.8 و 8 كيلوباسكال مع أوستيوبونتين.
ومع ذلك ، أظهر GS122 فقط مقاومة معززة للتيموزولوميد في حالة ثمانية كيلوباسكال. أخيرا ، يمكن استخدام منصة زراعة 3D المصغرة هذه لزراعة الخلايا البشرية من أنواع الأورام الأخرى ، بما في ذلك المواد العضوية القابلة للحياة لخلايا سرطان البروستاتا العصبية الصماوية المتباينة نهائيا. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام المزيد من التقنيات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لزيادة توصيف الأنماط الظاهرية للخلية.
