This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

1. إعداد Micropatterned قوالب والهلاميات المائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج المطلوب أنماط الصغيرة الحجم باستخدام SU-8 مقاومة للضوء على سطح رقاقة السيليكون عن طريق معيار من خطوتين تقنية ضوئيه 15،17 لقوالب الصب PDMS. على سبيل المثال أظهرت يستخدم نمط شبكة تشبه فصيص الكبد (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج PDMS وحل كيل علاج مع نسبة 1: 5 (أي 12.5 غرام من PDMS و 2.5 غرام من وكيل علاج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج 15 غراما من حل شامل، ديغا فقاعات في فراغ الغرفة، وانتشرت بعد ذلك في حل مختلطة على سطح micropatterned من رقاقة السيليكون بالتساوي داخل طبق احباط الصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة السيليكون على طبق من ذهب 65 درجة مئوية ساخنة لمدة 90 دقيقة على سطح مستو لعلاج PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PDMS الشفاء من الطبق الصب ورقاقة السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حواف PDMS وضعه على طبق بتري 100 ملم قطرها معالجانب حتى micropatterned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PDMS الشفاء micropatterned على طبق بتري باستخدام 70٪ من الإيثانول والماء المقطر لمدة التعقيم الابتدائي. ثم، وتجفيفها تماما لمدة 10 دقيقة في فرن عند 65 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل وتخلط O / N 3 غرام من السطحي غير أيوني المجفف في 100 مل من الماء المقطر، وخلق 3٪ (ث / ت) حل الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع PDMS قوالب micropatterned في نظافة البلازما وتنظيفها لمدة 1 دقيقة (85 W، 0.73 ملي بار) لإنشاء سطح ماء، لتسهيل إضافة السوائل المائية. ثم، ومعطف سطح PDMS مع حل 100 مل السطحي لا يقل عن 3 ساعة (أورو / N) باستخدام الروك المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الحل السطحي من قوالب PDMS وتجفيفها تماما في فرن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم، وتعقيم كل قالب micropatterned عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) الأشعة أكثر من 30 دقيقة. </li></ol> 2. إعداد تعليق خلية في هيدروجيل السلائف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلىإعداد هيدروجيل السلائف، حل 0.1 غرام من مسحوق الجينات الصوديوم في 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وخلق 1٪ (ث / ت) السلائف الجينات. لإذابة مسحوق تماما، واحتضان ومزجها O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون متصلة حقنة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا HepG2 في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين الستربتومايسين على طبق نسيج الثقافة التقليدية حتى 70٪ - 80٪ التقاء في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني، ثم يعرض للتريبسين لهم عن طريق إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لمدة 4 دقائق في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي الخلايا التي تحصد من الطبق الثقافة في 250 x ج لمدة 3 دقائق و resuspend باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني بعد إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا وحيدة الموزعة في PBS باستخدام خلية الآليالعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة PBS، إضافة 1 مل من 1٪ (ث / ت) من حل الجينات الصوديوم إلى الخلية بيليه المتبقية ومزجها برفق باستخدام pipetting ل. يجب أن تكون كثافة البذر النهائية للخلايا 5 × 10 يونيو - 10 يوليو خلية / مل. احتضان تعليق خلية / هيدروجيل في حاضنة ترطيب 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 3. تحميل وعبر ربط خلية / هيدروجيل تعليق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1.47 غرام من كلوريد الكالسيوم يذوى في 100 مل من ده 2 O لإنتاج كاشف عبر ربط (أي 100 ملي CaCl 2 · 2H 2 O في ده 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف داخل المرطب مع محول بالموجات فوق الصوتية باستخدام الايثانول 70٪، وملء مع 200 مل من كاشف عبر ربط. المرطب هو 110 ملم واسعة، 300 مم طويل و 170 ملم العميق (أي 110 مم × 300 مم × 170 مم (W خ ح خ د)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع PDMS micropatternedقوالب في نظافة البلازما وتنظيفها لمدة 1 دقيقة في 85 W لخلق سطح ماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باطراد تحميل 7.2 ميكرولتر للتمتزج جيدا خلية / هيدروجيل تعليق على حافة micropattern في القالب. على سبيل المثال أظهرت يستخدم نمط شبكة تشبه فصيص الكبد (الشكل 1). حجم تعليق يعتمد على نمط الطبوغرافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق دبق لتعليق الخلية / هيدروجيل، بدوره على المرطب والتحقق من أن تنتج المرطب رذاذ كاشف عبر ربط. رش كاشف عبر ربط على السلائف هيدروجيل لمدة 5 دقائق، والتي تغطي سطح الطبوغرافية من قوالب PDMS ضمن نطاق 5 سم. ملاحظة: لمسافات أطول وأقصر من 5 سم يمكن أن يسبب دبق غير مكتملة وغير متكافئ، على التوالي. ضمان المرطب لديها معدل الرش من 250 مل / ساعة، وتنتج 20 مل من ضباب كاشف عبر ربط في 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أعقاب عملية عبر ربط، إيقاف المرطب وملء مو PDMSلدس مع برنامج تلفزيوني. </li></ol> 4. التعامل مع ورقة واحدة وحدات هيدروجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل كل ورقة هيدروجيل صلابة من قوالب micropatterned عبر pipetting لPBS بلطف حول ورقة هيدروجيل باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط كل ورقة هيدروجيل العائمة باستخدام 1000 ميكرولتر نهاية ماصة قطع نهاية. كل ورقة هيدروجيل شبكة تشبه فصيص الكبد لديها أبعاد 8 مم × 8.7 مم، وتكون 100-200 ميكرون سميكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طبقة واحدة من ورقة هيدروجيل إلى 1 مل من DMEM في لوحة 12-جيدا، والثقافة الخلايا في المختبر بطريقة العائمة باستخدام هيدروجيل بناء كمكون الوحدة في 12 لوحة جيدا أكثر من أسبوع في 5 ٪ CO 2 مرطب حاضنة عند 37 درجة مئوية. تبادل مستنبت كل يوم. </li></ol> 5. الجمعية من متعدد الطبقات صفائح هيدروجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،1-1،5 لإنتاج إطار PDMS مع أبعاد 18 مم × 18 مم × 4 ملم (العرض ×ح خ د)، والذي يحتوي على هياكل دعامة 170 ميكرون عالية على السطح السفلي. استخدام 42 غرام من مزيج من PDMS وكيل علاج، مع نفس النسبة كما في الخطوة 1.2. وضع قالب البولي المتخصصة على رقاقة السيليكون للإطار PDMS لخلق إطار الداخلية مع أبعاد 8 مم × 9 مم × 2 مم (W خ ح خ د). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم إطار PDMS و 180 ميكرون مسام أوراق الترشيح النايلون المغمورة في الماء المقطر وملاقط في الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع PDMS إطار تعقيمها على ربع قطعة من ورق الترشيح النايلون (بقطر 5 سم) في 60 ملم طبق بتري قطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ورقة هيدروجيل وحدات في المناطق الداخلية من الإطار PDMS باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة قطع نهاية. وينبغي مثقف الأوراق هيدروجيل تستخدم للتجميع على الأقل يوميا بعد أن كانت ملفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة حافة كل ورقة هيدروجيل حدات مع الإطار PDMS باستخدام فارغة 200 ميكرولتر ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.4 و 5.5 باستخدام أوراق هيدروجيل حدات لتشكيل كومة من 4-6 طبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت التي تتدفق بها من خلال الهياكل عمود في الجزء السفلي من الإطار PDMS. ثم إضافة 2 ميكرولتر من محلول الجينات (2٪ ث / ت) في ركن من أركان بناء متعدد الطبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش رذاذ كاشف عبر ربط لمدة 30 ثانية على بناء متعدد الطبقات إرفاق حواف كل طبقة مع نظيرتها في بلد آخر. استخدام 2 مل من ضباب كاشف عبر ربط (بمعدل رش 250 مل / ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بناء متعدد الطبقات بلطف مع 400 ميكرولتر DMEM وإزالة الإطار PDMS باستخدام الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بناء متعدد الطبقات من ورقة الترشيح عن طريق المسح برفق مع خلية رافع بعد إضافة 4 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بناء لوحة 6 جيدا تحتوي على 3 مل من DMEM استعمال ورق الترشيح، والثقافة الخلايا في المختبر بطريقة عائمة، مع هيدروجيل بناء كما متعددة الطبقاتسقالة الخلوية متعددة النطاق في لوحة 6 جيدا أكثر من أسبوع في حاضنة ترطيب 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. تبادل مستنبت كل يوم. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li><li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities.">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li><li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels.">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li><li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas.">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li><li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays.">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions.">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li><li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel.">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li><li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks.">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117 (2011).</li><li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules.">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li><li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking.">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions.">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol&#8722;Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures.">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol&#8722;Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction.">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li><li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters.">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li><li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip.">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li><li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels.">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).</li><li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids.">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li><li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+biomaterial.">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li><li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering.">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li><li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials.">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لافتعال صحائف هيدروجيل وحدات، وتجميع لهم لتشكيل السقالات الخلوية 3D. لبناء واضحة الهياكل الجينات منقوشة في وقت قصير، يجب أن نحدد عملية عبر ربط التي يمكن أن تخلق هياكل جامدة بما فيه الكفاية للحفاظ على micropatterns معقدة من القالب، وكذلك الحفاظ على سلامة الخلية والتمثيل الغذائي. قمنا بتطوير عملية عبر ربط، بما في ذلك الانتقال سول-جل، للرش كاشف عبر ربط باستخدام المرطب على شكل ضباب. بدون هذه العملية عبر ربط، لا يمكن أن يتم إنشاء أنماط الصغيرة الحجم في شكل هيدروجيل رقيقة بناء مع عمق محدود ناشر (100-200 ميكرون)، التي لديها نفاذية عالية للناشر الأيض والمواد المغذية. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الطرق القائمة على نشر القائمة، التي تتطلب 30-60 دقيقة، 18-20 منظمة الشفافية الدولية عبر ربطلي كانت قصيرة نسبيا (3-5 دقيقة). وعلاوة على ذلك، كان أيضا تحديا للتلاعب في أوراق هيدروجيل رقيقة، والتي كانت مستقرة ميكانيكيا فقط في وسط سائل. كما هو مبين في الشكل 1، وبكل بساطة ومستقر عالجت هيكل هيدروجيل رقيقة والتلاعب بها باستخدام معلومات سرية قطع نهاية التقليدي لانتقاله بين الظروف زراعة مختلفة. باستخدام تقنيات الجيل والتلاعب، ونحن يمكن أن توفر ليس فقط ورقة واحدة طبقة بطريقة عائمة للتطبيقات المحتملة في فحوصات المخدرات ولكن هياكل متعددة الطبقات مكدسة أيضا، مع التطبيقات المحتملة كما السقالات للبنيات الأنسجة مثل. يمكن إنشاء أبنية الخلوية متعددة الطبقات من التراص ورقة هيدروجيل طبقة واحدة وحدات (الشكل 3A). قد تحتوي كل ورقة هيدروجيل حدات اختلاف أنواع الخلايا، ويمكن أن تتعرض لظروف ثقافة مختلفة. هذه التركيبات متعددة الطبقات ومن ثم يمكن عاصم انتقائينزف. ومع ذلك، قد ببساطة التراص ورقة هيدروجيل يؤدي إلى نخر خلوي من داخل هيكل تجميعها عندما يتجاوز عمق إجمالي عمق ناشر محدود (الشكل 3C). للتغلب على هذه المشكلة، سيكون من الضروري لمواءمة أنماط micromesh، مثل الكبد مثل فصيص تنسجم، عندما يتم تجميع أوراق هيدروجيل متعدد الطبقات. لذا نحن بحاجة إلى إطار PDMS مع نفس النمط الداخلية مثل الحدود ورقة هيدروجيل لمحاذاة الأوراق هيدروجيل مكدسة. وبالتالي، يمكن أن تستخدم الانحياز micropatterns ثقب مجموعة في الأوراق هيدروجيل شبكة تجميعها لتشكيل الهياكل خط أنابيب توسيع وتسهيل نقل العناصر الغذائية أكثر فعالية لتحسين بقاء الخلية (الشكل 3B). واحد الحد من هذه التقنية هو عدم وجود تفاعلات خلايا المصفوفة في هيدروجيل الجينات. لا يمكن الجينات توفير بروابط التصاق الخلايا في الجسم الحي تشبه خلية مصفوفة التفاعلات (21)؛ ومع ذلك، فإنه منإيه الآثار الميكانيكية والهندسية كما سقالة-التغليف خلية 3D مع التفاعلات خلية خلية. للخلايا الأولية والخلايا الجذعية، ويمكن استخدام الجينات التعديل التالي مع الببتيدات التي تحتوي على RGD، 21 أو بالاشتراك مع الكولاجين أو الجيلاتين. 14،18 الحد الآخر هو أنه بمجرد هي ملفقة الأوراق هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من الخلايا مع كثافة الخلايا منخفضة أدناه 5 × 10 6 خلية / مل، وبناء هيكل متعدد الطبقات يمكن أن يسبب إرفاق ملفات ضعيفة بين الأوراق هيدروجيل فقط لأن حافة بنية ثابتة عن طريق استخدام الجينات إضافية. ومع ذلك، فإن الطبقات يمكن أن تكون مكدسة بشكل مضغوط كما سقالة واحدة عبر بنية الصرف الصحي تحت إطار PDMS. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن أعلى كثافة من الخلايا في ورقة هيدروجيل تتكاثر على سطح وكذلك داخل طبقة بعد ثقافة يوم واحد، والذي من شأنه أن يساعد مرفقات بين طبقات كما هو مبين في الشكل 3A. وفابريكا ورقة هيدروجيلنشوئها والتلاعب تقنية الموضحة هنا يمكن تكييفها وفقا لأنظمة الثقافة في المختبر ونماذج الخلوية الأنسجة مثل توفير في الجسم الحي تشبه المكروية لتقديم الطلبات، بما في ذلك المقايسات الخلوية والهندسة الأجهزة الاصطناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لفحوصات المخدرات خلية القاعدة والدراسات البيولوجية التي تتطلب مختلفة هندسيا الصغرى الخلوية 3D وmacroenvironments التي تتضمن خلايا مختلفة أو أنواع هيدروجيل.

الهلاميات المائية بشكل خاص الحيوية واعدة، ويتوقع أن تكون مهمة في البيولوجيا الأساسية، المقايسات الدوائية والطب. وقد اقترح 1 Biofabrication من بنيات الخلوية القائم على هيدروجيل للحد من استخدام التجارب على الحيوانات، 2،3 استبدال أنسجة للزرع و 4 و تحسين المقايسات خلية القاعدة. 5،6 التي تحتوي على المياه (الكهرومائية) المواد اللزجة (الهلام) تسمح لعدد كبير من الخلايا لتكون مغلفة وصيانتها في بنية سقالة للسيطرة على المكروية الخلوية 3D. في تركيبة مع توجيه التكنولوجيات ميكروفلويديك أو micropatterning، الهندسة للبنيات هيدروجيل يمكن التحكم بدقة في نطاق الخلوية. حتى الآن، ومجموعة متنوعة من الأشكال من الهلاميات المائية، بما في ذلك الجزيئات، 7-9 الألياف، 10-12 ووريقات 13-15 وقد استخدمت وحدات البناء في APPRO من أسفل إلى أعلىأوجاع لتصنيع الماكرو النطاق أبنية متعددة الخلايا. وكانت كل من الجسيمات القائم على هيدروجيل والألياف ملفقة بسهولة وبسرعة لتطبيقات عن البيئات الخلوية الصغيرة الحجم، مع وجود ضوابط الموائعية باستخدام أجهزة ميكروفلويديك. لكن، وكما الوحدات الأساسية للأنسجة هندسيا، سيكون معقدا لإعادة ترتيبها وتكبير حجمها كما يبني المستوى الكلي. 16 ومن الأصعب لتحقيق بنيات الكلية تحجيمها من لإنتاج وحدات الأساسية ميكرون الحجم. وحدات ورقة مثل من يبني على أساس هيدروجيل يمكن استخدامها لزيادة حجم السقالات عن طريق عملية التجميع بسيطة. ويترتب على ذلك طبقات مكدسة من الأوراق هيدروجيل توفر ليس فقط زيادة الحجمية ولكن أيضا تمديد هندسية في الفضاء 3D. لقد ذكرت سابقا وسيلة لافتعال صحائف هيدروجيل micropatterned، 13-15 جنبا إلى جنب مع تجميع هذه الجزيئات متعددة تسريحأبنية الخلوية الدو. تقنية تمكن micropatterning معقدة وتصميم وحدات من البنى الخلوية عن طريق عملية زرع هياكل متعددة الطبقات. من خلال تلفيق مكدسة ورقة هيدروجيل وحدات، والتي micropatterned، نظام زراعة الخلايا 3D مع المكروية الخلوية المستوى الكلي التي تسيطر عليها لا يمكن أن تتحقق. يصف هذا البروتوكول فيديو طريقة تصنيع بسيطة لكنها قوية والتي يمكن استخدامها لبناء وحدات صفائح هيدروجيل، استنادا إلى الكبد البشري خط خلية سرطان (HepG2). علينا أن نبرهن تلاعب بسيط هنا من هذه الأوراق هيدروجيل حدات منقوشة، وتجميعها في هيكل متعدد الطبقات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:163px;">000000000001064291</td>
			<td style="width:397px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">P2443</td>
			<td>Powdered nonionic surfactant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Alginic acid sodium salt, low viscosity</td>
			<td style="width:111px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:163px;">B25266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultrasonic humidifier</td>
			<td style="width:111px;">MediHeim</td>
			<td style="width:163px;">MH-2800</td>
			<td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 mL/h</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Nylon net filter hydrofilic, 180 &#956;m</td>
			<td style="width:111px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:163px;">NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Polycarbonate mold</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

ويمكن نمط الهلاميات المائية على النطاق الصغير باستخدام تقنيات الموائع الدقيقة أو micropatterning إلى توفير في الجسم الحي تشبه الهندسة ثلاثية الأبعاد (3D) الأنسجة. وقد أدخلت الناتجة يبني على أساس هيدروجيل 3D الخلوية كبديل للالتجارب على الحيوانات للدراسات البيولوجية المتقدمة، المقايسات الدوائية والتطبيقات زرع الأعضاء. على الرغم من أن الجزيئات على أساس هيدروجيل والألياف يمكن أن تكون ملفقة بسهولة، فمن الصعب التلاعب بها لإعادة بناء الأنسجة. في هذا الفيديو، ونحن تصف طريقة لتصنيع صفائح الجينات هيدروجيل micropatterned، جنبا إلى جنب مع التجمع لتشكيل خلية نظام الثقافة 3D الماكرو النطاق مع المكروية الخلوية التي تسيطر عليها. باستخدام نموذج ضباب وكيل التبلور الكالسيوم، يتم إنشاء ورقة هيدروجيل رقيقة بسهولة مع سمك في حدود 100-200 ميكرون، ومع micropatterns دقيق. ويمكن بعد ذلك مثقف الخلايا مع التوجيه الهندسي للأوراق هيدروجيل فيشروط قائما بذاته. وعلاوة على ذلك، فإن ورقة هيدروجيل يمكن التلاعب بها بسهولة باستخدام micropipette مع تلميح نهاية المعالم، ويمكن تجميعها في هياكل متعددة الطبقات بتكويمهم باستخدام polydimethylsiloxane نمط (PDMS) الإطار. هذه الأوراق هيدروجيل وحدات، والتي يمكن أن تكون ملفقة باستخدام عملية السطحية، لها تطبيقات محتملة في المختبر فحوصات المخدرات والدراسات البيولوجية، بما في ذلك الدراسات الفنية الدقيقة وmacrostructure وإعادة الإعمار الأنسجة.

وصفناها تصنيع والتلاعب قائما بذاته ورقة هيدروجيل الخلوية. كما هو مبين في الشكل 1، ونحن ملفقة PDMS قوالب micropatterned، وكانت محملة هيدروجيل التي تحتوي على الخلايا على سطح ماء من هذه القوالب وعبر المرتبطة باستخدام المرطب لتوليد ضباب على هيئة إيروسولات من التبلور وكيل. بعد إطلاق سراحه من القوالب، وكانت الخلايا المستزرعة في HepG2 قائما بذاته ورقة هيدروجيل مع مختلف أنماط (الشكل 2). وهكذا، قدمت ورقة هيدروجيل رقيقة بيئة ثقافة 3D. وعلاوة على ذلك، يمكن تجميع أوراق هيدروجيل وحدات من قبل طبقات الأوراق باستخدام micropipette مع تلميح قطع نهاية، وباستخدام إطار PDMS، والتي تمكن 3D زراعة الخلايا المستوى الكلي (الشكل 3). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig1.jpg" /> الشكل 1. تدفق تشاRT عرض للتصنيع ورقة هيدروجيل ومتعدد الطبقات ورقة هيدروجيل. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig2.jpg" /> الشكل 2. طليق 3D خلية الثقافة في مختلف صفائح هيدروجيل. إن طريقة تصنيع الرش كاشف عبر ربط تمكين الزخرفة الدقيقة للهيدروجيل الجينات على المستوى الجزئي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تحصد أوراق هيدروجيل ملفقة من العفن والتلاعب بها بسهولة في ظروف قائما بذاته. ونمط الخلايا HepG2 والمثقف في ورقة هيدروجيل شقة (A)، وصحائف هيدروجيل مع أعمدة سداسية (B)، شبكة (C)، الكبد مثل فصيص شبكة (D)، ومجموعة من الثقوب (E)، وmultiplه-مثل microcomb microfibers (F). أشرطة النطاق هي على النحو التالي: 500 ميكرون (A، D، F)، و 100 ميكرومتر (B، C)، و 2 ملم (E) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53475/53475fig3.jpg" /> الشكل 3. جمعية Micropatterned صفائح هيدروجيل على نطاق والماكرو-الخلوي التركيبات. أنواع مختلفة من ورقة هيدروجيل يمكن تجميعها عبر طبقة تلو طبقة التراص مع المحاذاة، بما في ذلك تجميع خمسة أوراق هيدروجيل تحتوي على خلايا HepG2 ملطخة مخضر والخلايا NIH3T3 ملطخة مضان أحمر (A). قدمت جمعية للأوراق هيدروجيل micropatterned مع أنابيب الهيكل الموسعة (B) أعلى بقاء الخلية ثان أن أوراق هيدروجيل غير منقوشة (C) بعد 7 أيام. تم تقييم الجدوى التي تلطيخ الخلايا HepG2 مع calcein-AM (الخلايا الحية كما هو مبين الأخضر) وإيثيديوم homodimer-1 (الخلايا الميتة كما هو موضح الحمراء). أشرطة النطاق: 500 ميكرون (A) و 200 ميكرومتر (B، C) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53475/53475fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture at JoVE.com

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

construction-modular-hydrogel-sheets-for-micropatterned-macro-scaled

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

Video: Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

رقاقة سلالة التدرج لتحفيز السلوكيات الخلوي في الخلية لادن المائية

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

بيوبرينتابل الجينات/الجيلاتين المائية 3D في المختبر النموذجي النظم الحث على تشكيل خلية كروي

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

بناء ورقة الطبقات الوسيطة من الخلايا الجذعية مع نظام 3D دينامية الثقافة

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D طبع السقالات السليلوز المسامية المائية نانوي

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

بروتوكولات 3D بيوريتينغ من الجيلاتين ميثاكريلويل هيدروجيل القائم علي الحيوية

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...