يصف البروتوكول نهجا مبسطا لفحص وعزل الميكروبات المقاومة للمعادن الثقيلة من الينابيع الحرارية الأرضية. ويمثل هذا النهج مجالا بحثيا يحظى باهتمام متزايد في جميع أنحاء العالم للتطبيق في مجال الاستشعار البيولوجي والمعالجة البيولوجية. يمكن تعديل الطريقة الموصوفة فيه بسهولة لعزل الميكروبات عن مصادر بيئية متنوعة مثل الماء أو الغذاء أو التربة أو الرواسب.
الحد الأدنى من التركيز المثبط لتحديد الميكروبات المقاومة هو استراتيجية سريعة لتوصيف الأنواع أو السلالات الجديدة. هذا البروتوكول سهل التنفيذ ولا يتطلب سوى مهارة يدوية وخبرة في تقنيات علم الأحياء الدقيقة الأساسية. للبدء ، قم بتلقيح غرامين من العينة التي تم جمعها في 50 ميكرولايت من وسط لوريا بيرتاني الطازج مع درجة حموضة أربعة أو سبعة.
احتضان هذه العينة في درجة حرارة موقع أخذ العينات زائد أو ناقص خمس درجات مئوية. قم بلوحة 200 ميكرولتر من العينة على أجار لوريا بيرتاني مع درجة حموضة أربعة أو سبعة وإبقائها في حالة ثابتة عند 55 أو 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة ، اعزل مستعمرات مفردة وكرر دورة طلاء الخط هذه ثلاث مرات على الأقل.
لإعداد ملليلتر واحد من مخزون الخلايا المجمدة ، أضف 20٪ من الجلسرين إلى الخلايا المزروعة بين عشية وضحاها. استخدم مزيجا من الأسيتون والثلج الجاف للتجميد السريع. لإعداد لقاح من مخزون الجلسرين ، قم بتلقيح 50 ميكرولتر في 50 ملليلتر من لوريا بيرتاني.
للحصول على ملف تعريف النمو ، قم بتخفيف هذه الثقافة السابقة في 10 ميكرولترات من Luria-Bertani. لضبط الكثافة البصرية إلى 0.1 أضف 600 نانومتر. تنمو هذه الخلايا لمدة 16 ساعة عند 55 أو 60 درجة مئوية في الاهتزاز المداري.
قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر على فترات 30 دقيقة. منحنى من هذه البيانات مع مرور الوقت على المحور X والكثافة البصرية عند 600 نانومتر على المحور Y. رسم منحنيات نمو مماثلة مع درجة الحموضة المتفاوتة من وسط الثقافة ، لتحديد الرقم الهيدروجيني الأمثل للظروف المختبرية ، وتلقيح العزلة المخططة من مخزون الجلسرين في 50 ميكرولتر من وسط لوريا بيرتاني واحتضانها بين عشية وضحاها.
قم بطرد مركزي هذه الثقافة المزروعة بين عشية وضحاها لمدة 10 دقائق عند 5،000 مرة G ثم تخلص من supernatant وحصاد لوحة الثقافة. تحضير 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل البكتيريا يتكون من 20 ملليمول Tris-HCL ، واثنين من الملليمولات EDTA ، و 1.2٪ Triton X-100 و 20 ملليغرام لكل ملليلتر ليسوسوم مباشرة قبل الاستخدام. أعد تعليق الكريات في 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبكتيريا.
استخراج الحمض النووي الجينومي وفقا للتعليمات الواردة في مجموعة التنقية وقياس الحمض النووي الجيني ونقائه بواسطة UV-Vis. لتقييم النقاء، حدد نسب الكثافة البصرية 260 إلى 280 ومن 260 إلى 230. تقييم سلامة الحمض النووي الجينومي عن طريق تحميل 200 نانوغرام من كل عينة على هلام الأغاروز بنسبة 0.8٪ ومقارنة توزيع الحجم بعلامة جزيئية للطول والوزن.
تنمو المعزولة من مخزون الجلسرين في 200 ملليلتر من لوريا بيرتاني الأس الهيدروجيني الأمثل وظروف درجة الحرارة. قم بتخفيف كل زراعة مسبقة في خمسة ملليلترات من وسط لوريا بيرتاني في 50 ملليلتر من أنابيب البولي بروبيلين التي تحتوي على تركيزات متزايدة من المعادن الثقيلة والمضادات الحيوية للحصول على كثافة بصرية تبلغ 0.1 عند 600 نانومتر. تنمو الخلايا لمدة 16 ساعة على شاكر مداري مع 180 دورة في الدقيقة عند 55 أو 60 درجة مئوية.
احسب الحد الأدنى للتركيز المثبط للمضادات الحيوية أو المعادن الثقيلة عن طريق تحديد قيم التركيز في الأنابيب التي لا يحدث فيها نمو ميكروبي. تحقق من أن التركيز مثبط وغير قاتل للخلايا عن طريق طلاء 200 ميكرولتر من الثقافة المزروعة بتركيزات مثبطة على الأقل على ألواح لوريا بيرتاني أجار والتحقق من وجود مستعمرات بعد الحضانة بين عشية وضحاها. تم استخدام هذا البروتوكول لاختبار عينات بكتيرية من منطقة Piscarelli ، وهي بيئة حرارية أرضية كبريتية حمضية أظهر التوصيف الظاهري للكائنات الحية الدقيقة المعزولة أن عزل واحد لديه تحمل أعلى للزرنيخ والفانادات ومقاوم للكادميوم.
تشير البيانات المقارنة إلى أن عزل واحد لديه مقاومة قوية للزرنيخ خماسي التكافؤ في حين أن عزل اثنين لديه مقاومة للزرنيخ ثلاثي التكافؤ. أظهرت اختبارات مقاومة المضادات الحيوية أن عزل واحد حساس للغاية لجميع المضادات الحيوية التي تم اختبارها حتى عند استخدام تركيزات منخفضة. في المقابل ، فإن العزل الثاني مقاوم لجميع المضادات الحيوية التي تم اختبارها باستثناء الكلورامفينيكول والتتراسيكلين.
من المحتمل أن تكون الكائنات الحية الدقيقة قد اكتسبت مقاومة للمضادات الحيوية بسبب الطفرات العشوائية أو نقل الجينات الأفقي الذي يمثل ميزة انتقائية في الظروف البيئية القاسية. توضح هذه الدراسة فائدة هذه الطرق لاختيار الكائنات الحية الدقيقة البيئية التي يمكن أن تعطل الملوثات وتحولها إلى منتجات غير ضارة.
