يصف البروتوكول كيفية تقييم إصابة الكبد التي يسببها الدواء في المختبر باستخدام نظام ميكروفيزيولوجي يمكنه الحفاظ على أنسجة الكبد الدقيقة عالية الأداء والنشطة الأيضية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع. هذا النهج هو نموذج زراعة الخلايا البشرية المحددة للكشف بدقة عن مسؤولية إصابة الكبد التي يسببها الدواء للمركبات الجديدة ، والتي هي أكثر تنبؤية من ثقافات 2D أبسط أو حتى ثقافات 3D أكثر تعقيدا. يمكن استخدام هذه التقنية كجزء من مجموعة من اختبارات السلامة قبل السريرية لتحديد ما إذا كان المركب آمنا لبدء التطوير السريري.
يمكن اختبار مجموعة متنوعة من الطرائق. ابدأ في إعداد النظام الفيزيولوجي المجهري للكبد عن طريق توصيل وحدة التحكم بمنزل محطة الإرساء في حاضنة زراعة الخلايا. تأكد من إضافة مجفف طازج إلى جرة التجفيف الموجودة في الجزء الخلفي من وحدة التحكم.
بعد تشغيل وحدة التحكم عن طريق الضغط على مفتاح هزاز القارب ، انتظر لمدة خمس دقائق حتى يستقر النظام ويصل إلى الضغط. قم بإزالة كل لوحة من العبوة. بعد ذلك ، قم بتجهيز كل بئر بإضافة 500 ميكرولتر من وسط DMEM المتقدم للبذر قبل التسخين إلى جانب الخزان.
ضع السائق على محطة الإرساء في الحاضنة. عند الانتهاء ، حدد البرنامج الرئيسي على شاشة وحدة التحكم حتى يأتي السائل من خلال دعامات المرشح. لتغطية القناة السطحية ، املأ جميع الآبار ب 1.1 ملليلتر من وسط DMEM المتقدم.
بعد وضع السائقين مع لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، قم بتوصيل محطة الإرساء ، وقم بتشغيل برنامج الحضانة. قم بإذابة قوارير PHHs و HJCs عن طريق الاحتفاظ بالقوارير في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تبقى قطعة صغيرة فقط من الجليد. بمجرد إذابة الجليد ، قم برفق بماصة بحد أقصى قارورتين من PHHs مباشرة في أنبوب من وسط استعادة خلايا الكبد المحفوظة بالتبريد مسبقا ، وسائط CHRM.
ثم استخدم ملليلتر واحد من CHRM لغسل الخلايا المتبقية من أنبوب التبريد. ماصة HKCs بلطف من أنبوب التبريد إلى 10 ملليلتر من البذر البارد الجليدي المتقدمة DMEM المتوسطة في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر. في وقت لاحق ، قم بالطرد المركزي لكلا النوعين من الخلايا بشكل منفصل في درجة حرارة الغرفة عند 100 مرة G لمدة 10 دقائق.
بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق PHHs في وسط DMEM المتقدم للبذر الدافئ و HKCs في وسط DMEM المتقدم للبذر البارد الجليدي باستخدام ملليلتر واحد لكل قارورة من الخلايا المضافة إلى الأنبوب. أعد تعليق الخلايا بحركة هزازة لطيفة ، ثم ضعها على الجليد. عند التعليق ، عد الخلايا وسجل الجدوى.
يجب أن تكون صلاحية الخلية أعلى من 85٪بعد ذلك ، افصل برنامج التشغيل عن محطة الإرساء ، وضع السائق في خزانة السلامة الميكروبيولوجية أو MBSC. ثم استنشاق الوسائط من فوق السقالة إلى نقطة التوقف والقناة والخزان ، تاركا حجما ميتا يبلغ 0.2 ملليلتر في بئر الثقافة ، ليصل إلى أعلى السقالة مباشرة. إضافة 400 ميكرولتر من وسط البذر المتقدم DMEM إلى حجرة البئر قبل إعادة السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة ، وتشغيل برنامج تغيير الوسائط لمدة ثلاث دقائق.
بعد ثلاث دقائق، افصل السائق عن محطة الإرساء، ثم أعد السائق إلى مركز MBSC. قم بشفط الوسائط من السقالة أعلاه وصولا إلى نقطة التوقف وفي نهاية الخزان لكل بئر ، متبوعا بإعادة تعليق PHHs عن طريق هز الأنبوب برفق ، وإضافة الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى كل بئر مزرعة. ماصة بعناية تعليق الخلية ، وضمان تشتت الخلايا عبر سقالة اللوحة.
أعد تعليق HKCs بعناية ، وأضف معلقات الخلية إلى كل مزرعة جيدا. بمجرد احتواء جميع الآبار على كلا النوعين من الخلايا ، ضع النظام الفيزيولوجي المجهري أو برنامج تشغيل MPS على محطة الإرساء في الحاضنة دون الاتصال فعليا للوقوف لمدة ساعة واحدة. بمجرد مرور ساعة واحدة ، قم بتوصيل السائق بمحطة الإرساء وقم بتشغيل برنامج البذور.
عندما يتوقف البرنامج تلقائيا لمدة دقيقتين ، قم بإزالة برنامج التشغيل من الحاضنة ، وأضف ببطء 1،000 ميكرولتر من وسط DMEM المتقدم للبذر إلى القناة لتحقيق حجم إجمالي قدره 1.4 ملليلتر. في وقت لاحق ، انقل الألواح إلى الحاضنة ، وقم بتشغيل بقية برنامج البذور لمدة ثماني ساعات. في اليوم الرابع ، أوقف البرنامج مؤقتا على وحدة التحكم ، وافصل السائق واللوحة عن محطة الإرساء.
قم بتحويلها إلى MBSC. استخدم ماصة لجمع ما يقرب من ملليلتر واحد من الوسائط يدويا من كل بئر لتحليل العلامات الحيوية القابلة للذوبان دون الإخلال بثقافة الخلية عن طريق لمس السقالة. قم بتسمية الوسائط التي تم جمعها كعينات اليوم الرابع ، وقم بتشغيل مقايسات نازعة هيدروجين اللاكتات واليوريا كفحص لمراقبة الجودة لضمان نجاح البذر.
بعد ذلك ، قم بجرعة كل بئر وفقا لخطة اللوحة عن طريق إجراء تغيير الوسائط. بمجرد الانتهاء ، أعد السائق إلى محطة الإرساء في الحاضنة ، وقم بتشغيل برنامج الاحتضان. في اليوم السادس، افصل السائق واللوحة عن محطة الإرساء، وانقلها إلى MBSC.
استخدم ماصة لجمع ما يقرب من ملليلتر واحد من الوسائط من كل بئر ، وقم بتسميتها كعينات بعد 48 ساعة من الجرعة وتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للمقايسات اللاحقة. في اليوم الثامن ، قم بإزالة السقالات من الألواح باستخدام زوج من الملقط ، وضع السقالات في صفيحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر دون إزعاج الأنسجة الدقيقة. التقط لقطات لكل سقالة تحت مجهر ضوئي مقلوب بتكبير 10 مرات.
في اليوم الرابع ، قبل جرعات الدواء ، تم إجراء فحص لمراقبة الجودة للأنسجة الدقيقة للكبد المشكلة مع إطلاق LDH وتوليف اليوريا. في اليوم الثامن ، تم تقييم مقاييس صحية وكبدية متعددة مثل الألبومين واليوريا و CYP ثلاثة A Four و ATP لتأكيد مستويات عالية من وظائف الكبد وقابلية التكاثر في الأنسجة الدقيقة. كشف الفحص المجهري لمرحلة التباين وتلطيخ IF في الأنسجة الدقيقة للكبد عن التوزيع المتساوي ل HKCs في الأنسجة الدقيقة PHH.
تسبب التعرض الحاد للأنسجة الدقيقة للكبد في حدوث سمية ، والتي تم اكتشافها بواسطة ألانين أمينوترانسفيراز أو ALT ، وإطلاق LDH وانخفاض سريع في إنتاج الألبومين واليوريا. أكد محتوى ATP ونشاط CYP Three A Four السمية التي يسببها troglitazone ، وكانت قيم EC50 قابلة للمقارنة إلى حد كبير مع نقاط النهاية الأخرى. تكشف صور الفحص المجهري ذات المجال الساطع التي تم التقاطها بعد زراعة ثمانية أيام في MPS عن نسيج دقيق صحي للكبد ، يتم زرعه بشكل موحد في جميع أنحاء السقالة في التحكم في السيارة.
شوهد موت الأنسجة أو تدهورها في النسخ المتماثلة المعالجة بالتحكم الإيجابي والتروجليتازون. علاوة على ذلك ، تم أيضا التحقيق في سمية الكبد بعد التعرض للبيوجليتازوني. لم يتم الكشف عن إطلاق LDH أو ALT ، ومع ذلك ، لوحظ انخفاض طفيف في إنتاج الألبومين واليوريا بعد 48 ساعة.
لوحظ انخفاض طفيف في محتوى ATP عند تركيزات عالية من البيوجليتازوني. تم إنشاء قيم EC50 من منحنيات استجابة الجرعة. كشف الفحص المجهري عن تغيير طفيف في الأنسجة الدقيقة بعد 96 ساعة من التعرض للبيوجليتازون عند أعلى تركيزين تم اختبارهما.
في الدراسة ، يعد استخدام الخلايا ذات النوعية الجيدة والجدوى فوق 85٪ أمرا ضروريا لتوليد أنسجة دقيقة 3D وظيفية وصحية للغاية في النظام الفسيولوجي المجهري. بعد هذا الإجراء ، يمكننا تقييم تفاعلات الأدينين والأدوية وإصابات الكبد التي يسببها الدواء في نماذج الأمراض مثل التهاب الكبد دلتا غير الكحولي أو نموذج مرض الكبد الدهني غير الكحولي الذي يستخدم الثقافة الثلاثية لخلايا متني الكبد وغير المتني.
