تسمح لنا بروتينات المستقبلات الضوئية الموسومة ب GFP ، مثل القناة الأيونية TRPL GFP ، بدراسة نقل البروتين في الخلايا العصبية باستخدام تقنيات غير جراحية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لمراقبة انحطاط المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، يمكن دراسة الأساس الجزيئي للأمراض الوراثية التي تؤدي إلى العمى لدى البشر في عين ذبابة الفاكهة.
يمكن تقييم التوطين الخلوي للبروتينات الموسومة ب GFP من خلال مراقبة التألق في التلميذ الكاذب العميق أو عن طريق الفحص المجهري للغمر بالماء. تسمح كلتا الطريقتين بالتحديد السريع لتوطين البروتينات البصرية ومراقبة العيوب الهيكلية للرابدوميرات بسبب انحطاط خلايا المستقبلات الضوئية. للحصول على صور عالية الجودة ، فإن الجانب الأكثر أهمية هو اتجاه عين الذبابة.
أثناء تنفيذ هذه التقنية ، يجب على المرء التركيز على ommatidia الموجودة قليلا نحو محيط العين. سأقوم بعرض إجراء تصوير DPP ، في حين سيتم عرض التقنيتين اللتين تستخدمان الفحص المجهري للغمر بالماء من قبل زميلتي ، الدكتورة كريستينا فاغنر ، وماتياس زيجر ، طالب الدكتوراه في مجموعتنا. لبدء التلميذ الكاذب العميق ، أو DPP ، التصوير ، وتخدير الذباب الذي يتراوح عمره بين يوم واحد وثلاثة أيام ، ووضع أحدهما في وسط هدف المجهر على جانبه بحيث تواجه العين اليسرى أو اليمنى الهدف شعاعيا بدقة.
قم بزيادة التكبير ليناسب العين بأكملها ، وتوسيط الأوماتيديا المركزية للعين. إذا كان ذلك ممكنا ، قلل من عمق مجال المجهر عن طريق ضبط الحجاب الحاجز المزدوج القزحية إلى إعداد ضحل. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجهري بأقصى كثافة.
بعد ذلك ، حدد مجموعة مرشح التألق للمجهر وفقا لبروتين التألق المعبر عنه في العينين ، واضبط مسار الضوء نحو الكاميرا المثبتة على المجهر. باستخدام ميزة التصوير المباشر داخل البرنامج ، اضبط سطوع الصورة على إعداد يكتشف إشارات محددة فقط من العين عن طريق رفع وقت التعرض واكتساب القيمة. أعد ضبط تركيز المجهر في العين لتوليد الصورة المتراكبة ل DPP.
ثم ، التقط لقطة من DPP الفلورسنت. لإعداد ذبابة في شكل قاتل ، قم بلصق قطعة من البلاستيسين على شريحة كائن وقطعة أخرى في وسط طبق بتري. املأ طبق بتري بالماء المقطر المبرد بالثلج وبعض رقائق الثلج.
ثم ضع ذبابة واحدة مخدرة بالجليد تحت مجهر ستيريو فوق شريحة الجسم المطلي بالبلاستيسين. أدر الذبابة على ظهرها ، واخترق دبوس حشرة من خلال مركز الصدر. ثبت الدبوس أفقيا على شريحة الجسم المطلي بالبلاستيك ، وقم بتوجيه العين اليسرى أو اليمنى للذبابة لأعلى.
بعد ذلك ، قم بإصلاح شريحة الكائن بعناية مع توجيه جانبها الخالي من البلاستيسين لأسفل في طبق Petri ، مما يمنع دوران رأس الذبابة. تأكد من تغطية عين الذبابة بالماء. بدلا من ذلك ، لإعداد ذبابة في شكل غير قاتل ، قم بنقل رأس الذبابة المخدر بالجليد أولا إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وادفع الذبابة بعناية نحو الطرف بالهواء المضغوط.
ثم ، باستخدام مشرط ، اقطع طرف الماصة أمام الرأس مباشرة ، وباستخدام ملاقط ، ادفع الذبابة بعناية بضعة ملليمترات في طرف الماصة. اقطع طرف الماصة مرة أخرى ، وادفع الذبابة مرة أخرى نحو الطرف بالهواء المضغوط بحيث يبرز رأس الذبابة فقط من طرف الماصة. بعد لصق قطعة من البلاستيسين على شريحة كائن ، اضغط على طرف الماصة فيه بحيث تتجه العين اليسرى أو اليمنى إلى الأعلى.
تأكد من توجيه العين بشكل صحيح تحت المجهر. للحصول على صورة، حدد هدفا للغمر بالماء. في حالة وجود اختلاف غير قاتل ، استخدم ماصة مختبرية للالتصاق بقطرة كبيرة من الماء المبرد على الجانب السفلي من هدف غمر الماء.
ضع شريحة الكائن بعناية مع الذبابة المعدة على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، اخفض هدف الغمر بالماء يدويا حتى يلامس سطح الماء أو تلمس عين الذبابة القطرة. ثم قم بتبديل مسار الضوء نحو كاميرا المجهر ، وقم بإنشاء صورة حية.
أعد ضبط التركيز البؤري للكاميرا، وقم بتقييم اتجاه العين، مع الأخذ في الاعتبار أن العين يجب أن تواجه هدف المجهر شعاعيا. استخدم برنامج جدول البحث للكشف عن التشبع الزائد. في حالة الذباب غير المصطبغ، اضبط وقت التعرض بحيث تكون ألمع وحدات البكسل أقل بقليل من حد التشبع لكل صورة.
قم بتسجيل صورة وحفظها كملف خام لأرشفة جميع البيانات الوصفية المقابلة للتسجيل. ثم قم بتصدير الصورة بتنسيق tif. لتحديد مدى تألق eGFP النسبي في الرابدوميرات الخاصة بالرسوم البيانية المجهرية للغمر بالماء، اضبط إعدادات ImageJ بالنقر فوق تحليل، ثم تعيين القياسات، وحدد فقط مربع القيمة الرمادية المتوسطة.
قم باستيراد صورة tif بالنقر فوق ملف، ثم فتح. اختر منطقة تمثيلية للصورة في التركيز البؤري، وقم بتكبيرها إلى 200 إلى 300٪ عن طريق الضغط بشكل متكرر على Control ومعا. بعد ذلك، حدد الأداة البيضاوية، وأثناء الضغط على المفتاح Shift قم بإنشاء تحديد دائري في الصورة أصغر بكثير من رابدومير فلورسنت واحد.
بعد ذلك، ابحث عن الحجم الدقيق المعروض أسفل شريط الأدوات في النافذة الرئيسية ImageJ. لقياس شدة التألق داخل التحديد الدائري، حرك الدائرة إلى الرابدومير الأول باستخدام مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح، وانقر فوق تحليل، ثم قياس. ستظهر نافذة نتيجة تسرد القيمة الرمادية المقاسة.
استمر في قياسات الرابدوميرات من اثنين إلى ستة ، وقم أيضا بقياس إشارة الخلفية. في حالة الذباب غير المصطبغ ، قم بإجراء قياسات إضافية لمناطق جسم الخلية المقابلة. قم بقياس تألق اثنين آخرين من الأوماتيديا ، مما يؤدي إلى ثلاث نسخ طبق الأصل تقنية.
ضع علامة على ommatidia التي تم تحليلها باستخدام أداة القلم الرصاص، واحفظ هذه الصورة للتوثيق. حدد القيم الرمادية المقاسة وانسخها من نافذة النتائج، والصقها في برنامج جدول البيانات لإجراء مزيد من العمليات الحسابية. فرز قيم كثافة التألق وفقا لأصلها في فئات rhabdomere وجسم الخلية والخلفية ، وحساب متوسط الكثافة من كل فئة.
بعد ذلك ، احسب الكمية النسبية من eGFP الموجودة في rhabdomere باستخدام الصيغة الأولى للعيون غير المصطبغة والثانية للعيون المصطبغة. بدلا من ذلك ، لتحديد مورفولوجيا العين عن طريق تألق eGFP في الرسوم البيانية المجهرية للغمر بالماء ، اختر ثلاثة أوماتيديا متجاورة في منطقة تمثيلية للصورة التي هي في بؤرة التركيز. قم بتقييم 18 rhabdomeres من الاختيار بشكل فردي وفقا لكثافة eGFP ، وحدة الحافة ، والتباين فيما يتعلق بإشارة الخلفية المحيطة.
وأخيرا، سجل الرابدوميرات المرئية بوضوح بقيمة اثنين، والرابدوميرات المرئية أسبوعيا بقيمة واحد، والرابدوميرات الغائبة بقيمة صفر لتوليد مؤشر انحطاط. في ذباب ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين اندماج eGFP TRPL ، يختفي التألق الرحيدي في الضوء بسبب نقل eGFP TRPL. وهذا يسمح بإجراء فحص جيني لتحديد الطفرات المعيبة في استيعاب eGFP TRPL.
في الذباب الضابط، ينتقل eGFP TRPL من الرابدوميرات إلى جسم الخلية بعد 16 ساعة من الإضاءة، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في التألق الرحيدي مقارنة بالحالة المظلمة المتكيفة. الحضانة المظلمة الثانية ترفع التألق الرابدوميرال مرة أخرى نحو القيمة الأولية. ومع ذلك ، في المتحور المعيب لنقل TRPL vps35MH20 ، لا يتغير نمط التألق بشكل كبير بعد 16 ساعة من الإضاءة والتكيف المظلم اللاحق لمدة 24 ساعة.
يمكن لطريقة القياس الكمي هذه اكتشاف عيب إعادة تدوير كبير من الناحية الإحصائية. يسمح الذباب ذو العيون البيضاء بالكشف عن إشارات التألق من كل من الرابدومير وجسم الخلية. في المقابل ، في الذباب ذو العيون الحمراء ، لا يمكن اكتشاف إشارات التألق إلا في rhabdomeres ولكن ليس في جسم الخلية.
فيما يتعلق بالقياس الكمي لتنكس الشبكية ، يمكن تقييم تألق eGFP TRP على مدار عدة أسابيع. عندما يتم الاحتفاظ به في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة و 12 ساعة لمدة أسبوعين ، انخفض مؤشر الانحطاط في الذباب المتحور ولكن ليس في الذباب المسيطر. في هذا البروتوكول ، يحتاج المرء إلى التمييز بين العيون المصطبغة وغير المصطبغة.
نظرا لأن التصبغ يؤثر على إشارة الفلورسنت ، فقد تم تحسين الفحص المجهري الكمي للغمر بالماء لكلتا الحالتين بشكل فردي. يعد التصوير DPP والفحص المجهري للغمر بالماء من الطرق عالية الإنتاجية ذات الدقة المحدودة. للتحقيق في التوطين تحت الخلوي ، نوصي بالفحص المجهري المناعي على أقسام الأنسجة.
لإجراء تحليل مفصل للأنماط الظاهرية التنكسية ، يمكن إجراء الفحص المجهري الإلكتروني.
