يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي باستخدام مصفوفة ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها تسمح بتصوير عالي الدقة للاتجار داخل الخلايا ببروتينات الغشاء السفلي باستخدام البروتينات الموسومة داخليا والمجهر فائق الدقة Airysscan. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تطويره لتصوير الاتجار داخل الخلايا ببروتينات الغشاء السفلي ، إلا أنه يمكن توسيعه لدراسة الاتجار بالبروتينات الأخرى ذات الأهمية والأنظمة البيولوجية الأخرى ، بما في ذلك زراعة الخلايا والمواد العضوية.
للبدء ، بعد تشريح مبيض ذبابة الفاكهة في PBS تحت نطاق تشريح ، أضف ملليلتر واحد من محلول التثبيت وقم بإصلاح المبيضين على منصة الجوز لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة محلول التثبيت وقم بإجراء غسلتين سريعتين ، كل منهما يحتوي على ملليلتر واحد من PBST. عن طريق عكس أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بلطف من خمس إلى ست مرات ، ثم إجراء أربع غسلات طويلة لمدة 10 دقائق لكل منها مع ملليلتر واحد من PBST على هزاز منصة التغذية.
بعد إجراء التثبيت والغسيل ، قم بإزالة PBST ، ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الحجب وقم بحظر المبيضين على هزاز منصة الجوز لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الحجب وإضافة 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية ، التي تحتوي على أجسام مضادة أولية مخففة بتركيزاتها المناسبة في محلول الحظر. احتضان بين عشية وضحاها على منصة الروك الجوز في 4 درجات مئوية.
بعد إزالة محلول الأجسام المضادة الأولي ، قم بإجراء غسلتين سريعتين وأربع غسلات طويلة ، كما هو موضح سابقا ، ثم قم بإزالة PBST وإضافة 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية فلورسنت من شأنها الكشف عن الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. احتضني المبيضين في محلول الأجسام المضادة الثانوي على هزاز منصة الجوز لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإجراء غسلتين سريعتين وأربع غسلات طويلة في PBST كما هو موضح سابقا على هزاز منصة التجويف. بعد الغسيل الأخير ، استخدم ماصة P-1000 لماصة المبيضين بلطف لأعلى ولأسفل في الأنبوب لفصل غرف البيض.
اسمح لغرف البيض بالغرق في القاع عن طريق إبقاء الأنبوب في وضع مستقيم لمدة خمس إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة PBST باستخدام ماصة باستور ، تاركا ما يقرب من 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBST المتبقي باستخدام ماصة P-200 وأضف قطرتين من وسط التركيب ، وهو ما يكفي للانتشار بالتساوي على زلة الغطاء.
للسماح بسهولة نقل وسط التركيب اللزج إلى الشريحة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق، اقطع طرف ماصة P-200. بعد ذلك ، انقل ببطء جميع غرف البيض في وسط التركيب إلى الشريحة الزجاجية ، مما يضمن عدم إنشاء فقاعات. تحت مجهر تشريح ، انشر بلطف وسائط التركيب وفصل غرف البيض باستخدام طرف ماصة P-200 جديد أو ملقط لتغطية منطقة بحجم زلة الغطاء تقريبا.
باستخدام الملقط ، ضع الغطاء بعناية على غرف البيض بزاوية لتجنب الفقاعات وتخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو في الظلام لمدة يومين للبلمرة. بمجرد معالجة وسائط التركيب ، يمكن تخزين الشريحة عند 4 درجات مئوية في الظلام لبضعة أسابيع للتصوير. لتصور التوطين داخل الخلايا لبروتينات الغشاء السفلي ، اضبط الهدف على 63x وضع قطرة من زيت الغمر بلطف على عدستها ، ثم ضع الشريحة على الهدف مع انزلاق الغطاء الذي يواجه الهدف لتحديد موقع العينة.
حدد المنطقة ذات الأهمية باستخدام عدسة المجهر الفائق الفلورسنت، ثم حدد تكوينا مع الإعدادات المناسبة للفلوروفورات لتصويرها كما هو موضح في المخطوطة. بمجرد تعيين التكوين، قم بتصوير العينة عن طريق تحديد Live ضمن وضع الاكتساب واضبط التكبير/التصغير بين 2 و 4x لتحسين منطقة المسح الضوئي للعينة. لكل قناة على حدة، حدد مسارا ضمن القناة وانقر على بث مباشر.
اضبط الكسب الرئيسي وطاقة الليزر أثناء استخدام أداة مؤشر المدى واتبع جميع الإرشادات لتجنب وحدات البكسل المشبعة كما هو موضح في المخطوطة، مع تكرار نفس الشيء لكل قناة. في نافذة تبديل وضع الاكتساب ، ضمن حجم الصورة ، انقر فوق SR لزيادة قدرات الكاشف إلى أقصى حد وضبط حجم الإطار تلقائيا. احتفظ بالمتوسط إلى لا شيء في وضع Airyscan لأنه عادة ما يكون غير ضروري وسيقلل من وقت الفحص.
ومع ذلك ، في بعض الحالات ، قد يؤدي متوسط 2x إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، ثم انقر فوق Snap للحصول على صورة. للحصول على مكدس Z ، انقر فوق خانة الاختيار Z-Stack ضمن علامة التبويب الاستحواذ. بعد ذلك ، حدد القناة المطلوبة لمراقبة العينة.
على سبيل المثال ، قناة DAPI وانقر فوق Live لبدء فحص مباشر ، ثم قم بتعيين نطاق ل Z-stack باستخدام مقبض الضبط الدقيق على المجهر. بعد ذلك، قم بتعيين نقاط النهاية لمكدس Z بالنقر فوق تعيين أولا وتعيين أخيرا. لإعادة البناء 3D الأمثل ، قم بتعيين الفاصل الزمني ل Z-stack أقل من 0.5 ميكرومتر لتعيين حجم الخطوة وانقر فوق بدء التجربة لبدء اكتساب Z-stack.
بمجرد الحصول على الصور أو مكدس Z ، انقر فوق خيار المعالجة ، ثم الطريقة وحدد معالجة Airysscan. قم بإجراء التصفية التلقائية للبدء وإذا لزم الأمر، قم بإجراء مزيد من المعالجة اليدوية عن طريق تغيير قيمة الدقة الفائقة للحصول على أفضل النتائج للعينة. بعد تحديد قيمة ريال سعودي المثلى، انقر فوق تطبيق لإنشاء صورة تمت معالجتها.
في حالة صور Z-stack ، قم بالمعالجة إما كشريحة Z واحدة أو كمكدس Z بالكامل بالنقر فوق مربع معالجة 3D. لتصور الاتجار بالبروتين في 3D بعد الحصول على مكدس Z ، قم بإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد بالنقر فوق رمز 3D في نافذة المعاينة ، والتي ستظهر في قسم التحكم في العرض في الصورة المعالجة Airyscan . من خيارات عرض 3D المختلفة، استخدم طرق العرض Surface أو Mixed عند عرض بنية الحويصلات.
للحصول على صورة عالية الجودة ، حدد الإعداد الدقيق لأن الإعداد الأسرع سيكون أقل دقة ويؤدي إلى عرض 3D ضعيف. بمجرد إنشاء الصورة ، قم بمعالجة صورة 3D عن طريق التكبير والتدوير للتركيز على الموقع المفضل. بعد الحصول على العرض ، ضمن علامة التبويب 3D ، حدد الدقة المعروضة ، ثم انقر فوق إنشاء صورة ، والتي ستنشئ لقطة للصورة في نفس الاتجاه الذي تم عرضه ويمكن حفظه وتصديره بتنسيقات ملفات مختلفة.
يمكن استخدام المجهر البؤري لتصور التوطين داخل الخلايا وترسب بروتينات الغشاء السفلي مثل Viking-GFP عند تحسين معلمات الاستحواذ. عندما يتم إجراء عملية الاقتناء ومعالجة الصور بشكل صحيح ، يزيد الفحص المجهري فائق الدقة من دقة الصورة مقارنة بالمجهر البؤري. كما يتضح من الصور المحددة بشكل أفضل في الاتجار داخل الخلايا ببروتينات الغشاء السفلي ، مثل الفايكنج.
يسمح الإسقاط المتعامد بتصور التوزيع الكلي للحويصلات والمقصورات التي تحتوي على بروتينات الغشاء السفلي في صورة واحدة باستخدام التصوير متحد البؤرة أو فائق الدقة. تم استخدام إعادة بناء 3D عن طريق تجميع كومة من مقاطع Z البصرية التي تم التقاطها بواسطة التصوير البؤري أو فائق الدقة لتقييم توطين وتوزيع بروتينات الغشاء السفلي داخل الخلايا. يمكن استخدام التصوير فائق الدقة لتحديد التوطين الدقيق لبروتينات الغشاء السفلي في ظروف الطفرات.
على سبيل المثال ، في الخلايا الظهارية القاضية Crag ، تتراكم بروتينات الغشاء السفلي بشكل قمي وأساسي ، مما يشير إلى أنها تتحكم في الإفراز المستقطب لبروتينات الغشاء السفلي. يمكن أيضا استخدام المجهر البؤري وفائق الدقة في تجارب التوطين المشترك. على سبيل المثال ، يوضح هذا الشكل التوطين المشترك الجزئي ل Viking-GFP وعلامة Golgi ، GM-130 ، مما يؤكد أن الفايكنج يتم فرزهم إلى Golgi قبل الإفراز.
لتصوير الاتجار ببروتينات الغشاء السفلي بكفاءة باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة ، نوصي بتركيب المبيضين بعناية وإيلاء اهتمام خاص عند تعيين معلمات الاكتساب والالتفاف. تم تحسين هذا البروتوكول لتصور الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي. ومع ذلك ، يمكن تعديله بسهولة لتصوير الاتجار بالبروتينات الأخرى ذات الأهمية بكفاءة.
