طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية

يوضح هذا البروتوكول طريقة تعديل وراثي مباشرة في المختبر للدراسة الجزيئية لمسار الإشارات الأولي المعتمد على السيليوم في مزارع سلائف الخلايا الحبيبية الأولية. نظرا للتكلفة ، وانخفاض الجدوى ، وضعف كفاءة طريقة النقل الحالية ، فإننا نقدم تقنية كهربائية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة للتحقيق في مسار الإشارات المعتمد على السيليوم في مزارع GCP الأولية. للبدء ، أضف 0.5 ملليلتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر من لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على زلات غطاء مغلفة ، واجعلها دافئة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.

ماصة العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر وتدور عند 200x G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلايا في 200 ميكرولتر من Opti-MEM. كرر هذا الإجراء مرتين لضمان عدم وجود وسيط استزراع متبقي في الأنبوب.

تعيين معلمات electroporation كما هو مدرج. ماصة تفاعل الكهربية بلطف لخلطها جيدا ، واستخدم طرف ماصة P200 طويل لنقل حجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر من الخليط إلى كوفيت الفجوة مليمترين. بمجرد أن يكون الكوفيت داخل غرفة الكوفيت ، اضغط على زر أوميغا الخاص بالمصدر الكهربائي ولاحظ قيمة المعاوقة من خلال الالتزام بحجم دقيق يبلغ 100 ميكرولتر.

يجب أن يكون نطاق قيمة المعاوقة حوالي 30 و 35. اضغط على زر البدء لبدء النبض. سجل القيم الحالية المقاسة بالجول الموضحة في إطار القراءة.

قم بإزالة الكوفيت من الغرفة. أضف على الفور 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع المسخن مسبقا إلى الكوفيت وأعد تعليقه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات. انقل تعليق الخلية على الفور إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا والتي تم إعدادها مسبقا.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. راقب الخلايا تحت المجهر الفلوري في اليوم التالي. في هذه الدراسة ، بدت كفاءة الكهربية للمجموعات المعالجة ب DMSO و SAG قابلة للمقارنة.

يوضح التلطيخ المناعي لعلامة السيليوم الأولية Arl13b أن معدل هداب GCP عند div-2 من الثقافة في كل من المركبة والمجموعات المعالجة ب SAG. يوضح معدل الهدب النسبة المئوية ل Pax6 التي تعبر عن GCPs التي تحمل سيليوم أولي على سطح الخلية عند div-2 بعد الكهربية. يوضح الشكل زيادة كبيرة في توطين EGFP السلس على محور السيليوم الأولي لخلايا GCP للتعبير عن Pax6 على مدار 24 ساعة بعد العلاج SAG ، مما يشير إلى تنشيط عميق لمسار إشارات القنفذ الأولي المعتمد على السيليوم.

من أجل تحقيق كفاءة أعلى في التفريغ الكهربائي ، يجب على المرء ضمان نقاء عال للبلازميد المستخدم ، ولا توجد وسائط ثقافة متبقية في خليط البلازميد الكهربائي. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل مباشر ومفيدا لتجارب التعديل الجيني في المختبر على الثقافات الأولية وأنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان.