هذه المنهجية مهمة من حيث أنها تسمح بطريقة قابلة للتكرار ودقيقة لتحديد كمية المنتجات الدوائية المطبقة موضعيا باستخدام تصوير رامان المتماسك. توفر منهجيات أخرى معلومات دوائية جلدية ضخمة ، في حين أن هذه المنهجية يمكن أن توفر معلومات دوائية جلدية سائبة ودقيقة مثل مسار تغلغل الدواء. وستسمح مسارات التصور والقياس الكمي والنفاذية بتطوير منتجات دوائية مع وضع مسار محدد في الاعتبار للوصول إلى الموقع المستهدف.
سيثبت إعداد الأنسجة أنه الجزء الأكثر تحديا في هذه المنهجية. يجب أن تكون الأنسجة رقيقة بما فيه الكفاية بحيث يمكن للمرء أن يكون قادرا على القراءة من خلال الجلد. لبدء إعداد أنسجة جلد أذن الفأر عارية ، والحصول على الفئران العارية القتل الرحيم وإزالة آذان الفأر باستخدام ملقط ومقص الجراحة المجهرية.
ثم ضع أذنا واحدة في طبق بتري كبير بحجم 60 ملم × 15 ملم. بعد ذلك ، اشطف أذن الماوس باستخدام PBS مرتين وجفف الأذن في كل مرة باستخدام ممسحة المهمة. إذا تم استخدامه في غضون 24 ساعة ، ضع الأذن في PBS في طبق صغير بتري 35 ملم × 10 ملم عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.
للاستخدام بعد 24 ساعة من الحصاد ، ضع الأذن في طبق بتري بدون PBS ، ثم قم بتغطية الطبق بالبارافيلم لتخزينه في الفريزر عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. أثناء العمل تحت الغطاء البيولوجي ، ضع أنسجة الجلد البشري في طبق بتري كبير مع جانب الطبقة القرنية متجها لأسفل بحيث يمكن الوصول إلى الدهون تحت الجلد. ثم استخدم الملقط والمقص المجهري لإزالة الدهون تحت الجلد.
بمجرد أن لا يمكن إزالة الدهون تحت الجلد باستخدام المقص ، استخدم مشرطا يمكن التخلص منه من 10 شفرات بزاوية 45 درجة على الجلد لإزالة الدهون المتبقية تحت الجلد مع إبقاء الجلد ثابتا باستخدام الملقط. عندما تتم إزالة الدهون ، قسم جلد الإنسان إلى سنتيمتر واحد في قطعة سنتيمتر واحد. لتصوير الدهون ، ضع الجزء الأمامي من أذن الماوس متجها نحو الجزء السفلي الزجاجي من طبق 35 ملم ، رقم صفر.
بالنسبة لجلد الإنسان ، ضع الجلد مع الطبقة القرنية المواجهة لأسفل للسماح بتحديد كمية الدواء من الطبقات السطحية إلى الطبقات العميقة. بمجرد تركيز الأنسجة على القاع الزجاجي ، استخدم قضيب طرف القطن للتأكد من أن الجلد مسطح ولديه اتصال كامل مع سطح انزلاق الغطاء في الطبق السفلي الزجاجي. لمنع أي حركة أثناء التصوير ، ضع غسالة فوق الجلد وتأكد من أن الأنسجة مرئية من خلال الثقب المركزي للغسالة لتحفيز تشتت رامان أو الكشف عن انتقال SRS.
ضعي الجرعة المحددة مسبقا من التركيبة على الجلد ، ثم استخدمي إصبعا قفازا لفرك التركيبة في اتجاه عقارب الساعة لمدة 30 ثانية. بعد انقضاء الوقت المخصص لتخلل التركيبة ، قم بإزالة التركيبة الزائدة قبل وضع الجلد مع توجيه جانب التركيبة نحو الطبق السفلي الزجاجي. بعد ذلك ، انتقل إلى الإعداد التجريبي عن طريق تشغيل برنامج التحكم في المجهر أو MC.
بالنظر إلى العدسة ، اضبط التركيز البؤري المحوري باستخدام مقبض الضبط للتأكد من أن الأنسجة ضمن نطاق التركيز البؤري. عند الانتهاء، قم بإلغاء حظر كل من المضخة وحزم ستوكس وتأكد من تمكين قنوات ALG1 و ALG2. تأكد من أن الصمام الثنائي الضوئي SRS في موضعه فوق المكثف، ثم انقر فوق التركيز x2 على برنامج MC لتصور الجلد في قناتي CARS وSRS.
في الفاصل الزمني متعدد المناطق أو وحدة MATL ، انتقل إلى علامة التبويب عرض وانقر فوق قائمة النقاط المسجلة لإظهار قائمة التصوير. بمجرد تحديد الطبقة القرنية، قم بالتمرير عبر التركيز المحوري أو التركيز Z لتحديد طبقات الأنسجة المحددة. يمكن إضافة أعماق محددة داخل الجلد مثل الطبقة القرنية أو الغدد الدهنية أو الخلايا الشحمية أو الدهون تحت الجلد ، كما هو محدد أثناء التصوير الحي مع تباين مضبوط للدهون.
ومع ذلك ، إذا كان سيتم أخذ مكدسات العمق بالكامل ، فيمكن إضافة مواضع XY ، ويمكن تجاهل موضع Z النسبي. في حالة تصوير عمق محدد لكل تقسيم طبقي للجلد ، حدد نقطة التسجيل لإضافتها إلى قائمة انتظار MATL. بالنسبة إلى مكدسات العمق الكاملة، انقر فوق تسجيل نقطة لكل موضع XY مع تحديد العمق في نافذة معلمات الاستحواذ.
بعد ذلك ، قم بتعيين عدد التكرارات إلى واحد في وحدة MATL النمطية وانقر فوق جاهز. عندما يتغير سهم "تشغيل" من الرمادي إلى الأسود، اضغط على "تشغيل" لبدء تصوير مكدس الدهون الأولي. بمجرد الانتهاء من دورة التصوير ، قم بحظر كل من المضخة وحزم ستوكس وتغيير الطول الموجي على واجهة المستخدم الرسومية بالليزر إلى الطول الموجي المطلوب بناء على رقم الموجة المستهدفة أو اهتزاز رامان.
اضبط مرحلة تأخير الوقت اليدوي مع التأكد من استخدام نفس القوى لتصوير المكون الدهني والصيدلاني النشط أو واجهة برمجة التطبيقات التي تم إنشاؤها مسبقا. بمجرد اختيار العدد الإجمالي لتكرار الدورة، قم بإلغاء حظر شعاع المضخة وتحقق مما إذا كانت الطاقة تتطابق مع الطاقة المطلوبة باستخدام الصمام الثنائي الضوئي قبل الضغط على Play لبدء التصوير التلقائي للنقاط المحددة. بعد ذلك ، قم بإجراء تحليل البيانات لكل تقسيم طبقي للجلد عن طريق استيراد صورة دهنية للغدة الدهنية إلى فيجي وتحديد المربع المسمى قنوات Split لتقسيم الملف إلى قنوات CARS و SRS.
لفتح منطقة الاهتمام أو مدير عائد الاستثمار ، انقر فوق تحليل وأدوات ومدير عائد الاستثمار. باستخدام قناة SRS بحيث C يساوي واحدا، قم بإزالة تحديد الغدة الدهنية في الصورة وأضف العلامات إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة T في إدارة عائد الاستثمار. كرر العملية لكل غدة دهنية داخل الصورة.
لإخفاء المناطق الغنية بالدهون، حدد كل عائد استثمار ثم انقر فوق المزيد، أو دمج، وإضافة علامات تبويب. لإخفاء المناطق الفقيرة بالدهون ، استخدم أداة المستطيل في قائمة فيجي وارسم مربعا حول الصورة بأكملها. أضف المنطقة إلى إدارة عائد الاستثمار.
انقر على عائد الاستثمار المربع المضاف حديثا بالإضافة إلى عائد الاستثمار الذي يحدد جميع المناطق الغنية بالدهون في مدير عائد الاستثمار. ضمن المزيد، حدد XOR لإنشاء قناع للمناطق الفقيرة بالدهون وإضافته إلى مدير عائد الاستثمار. قم بتسلسل الصور بترتيب رقمي من خلال الانتقال إلى الصورة والمكدسات والأدوات وعلامات التبويب المتسلسلة بالترتيب.
بدلا من ذلك ، قم باستيراد الصور عن طريق تحميل واحدة إلى فيجي ثم تحديد خيار يسمى تجميع الملفات ذات الأسماء المتشابهة في صفحة الإعداد. أثناء تنشيط الصورة المتسلسلة ، انتقل إلى مدير عائد الاستثمار لتحديد المناطق الغنية بالدهون وانقر فوق علامة التبويب المزيد قبل تحديد القياس المتعدد ، ثم انتظر حتى تظهر نافذة النتائج. من نافذة النتائج، قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات وأضف عمودا بعنوان المنطقة لإضافة مناطق غنية بالدهون إلى كل صف من صفوف البيانات.
أضف الدهون الفقيرة إلى المناطق التي كانت خارج الدهون. لتصور البيانات، احفظ جدول البيانات واستورده إلى حزمة R، ggplot2. ثم ارسم البيانات كدالة لرقم الصورة مقابل متوسط الكثافة لتقدير بيانات وقت التركيز.
قم بتشغيل التحليل غير المجزأ أو NCA في RStudio على بيانات وقت الكثافة المستوردة من جدول البيانات مع استدعاء طبقة واحدة. عند الانتهاء من ذلك ، قم برسم ومقارنة مقاييس Jmax و AUCflux-all بصريا. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء مقارنات إحصائية عبر الظروف التجريبية.
يصور التحليل التمثيلي الطبقة القرنية ، والغدد الدهنية ، والخلايا الشحمية ، والدهون تحت الجلد من جلد أذن الفأر العاري ، والطبقة القرنية ، والأدمة الحليمية ، والغدة الدهنية من جلد الإنسان. في جلد أذن الفأر العاري ، لوحظت حركة الأنسجة المحدودة للغدد الدهنية بنفس عمق أنسجة الغدد في وقت تطبيق التركيبة وبعد 120 دقيقة من التطبيق. أظهرت حركة الأنسجة الكبيرة في الجلد غدد دهنية بالكاد مرئية بعد 120 دقيقة من تطبيق الدواء ، مما يدل على عدم كفاءة البروتوكول الأصلي.
في العديد من الدراسات ، أظهرت ملامح الكثافة مقابل الوقت تركيزات أولية عالية ، تليها تركيزات متناقصة ، مما يشير إلى عدم وجود امتصاص آخر للدواء في الأنسجة. من ناحية أخرى ، أشارت بعض الدراسات إلى ارتفاع في الشدة التي انخفضت لاحقا خلال الفترة التجريبية ، مما يدل على أن التدفق إلى الأنسجة لم يصل إلى الحد الأقصى قبل التصوير. وأشار تحليل NCA لملامح وقت التركيز لتركيبتين لنفس واجهة برمجة التطبيقات إلى أن الإيثوكسي - إيثوكسي إيثانول يوفر نفاذية API موسعة مقارنة بتركيبة الجل بغض النظر عن طبقة الجلد.
أظهر تحليل التعرض الكلي بين نفس التركيبات ملاحظات مماثلة في الطبقات العميقة من الجلد. يعد تحضير جلد الإنسان ووضع الجلد بشكل صحيح على الطبق السفلي الزجاجي بعد تطبيق الدواء أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. وتبين الحلول الواضحة هنا مدى ملاءمة هذه المنهجية.
وسيشمل المزيد من الأبحاث تركيبات مسوقة مثل الكريمات لفهم كيفية تأثير التركيبة على اختراق واجهة برمجة التطبيقات ونفاذيتها.
