يوفر هذا البروتوكول تقنية للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاطات الأوراق والمضيفات النباتية لمزيد من التحقيق في وظيفة هذه البروتينات في مضيفات النبات. هذه التقنية سهلة التنفيذ والنظام مستقر وقابل للتكرار. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة أيضا في الكشف عن البروتينات اللعابية للفالج والمضيفات النباتية الأخرى.
للبدء ، قم بتربية نطاطات الأوراق البالغة على شتلات الأرز في قفص مكعب 40 × 35 × 20 سم. احتفظ بجانب واحد من القفص مغطى بشبكة مقاومة للحشرات للتهوية. ضع الأقفاص مع نطاطات الأوراق في حاضنة تحتوي على وحدة تحكم رطوبة مدمجة عند 26 درجة مئوية مع رطوبة نسبية من 60 إلى 75٪ تحت فترة تصوير 16 ساعة ضوء وثماني ساعات مظلمة.
مرة واحدة في الأسبوع ، استخدم شفاطا لنقل جميع البالغين برفق من قفصهم إلى قفص جديد يحتوي على شتلات الأرز الطازجة. اسمح لأكثر من 200 شخص بالغ بالتزاوج ووضع البيض في الأرز. احتفظ بشتلات الأرز القديمة حتى تظهر الحوريات وتربية هذه الحوريات الجديدة غير الخبيثة إلى المرحلة الثانية.
باستخدام الشافطة ، انقل بعناية الحوريات الثانية غير الخبيثة إلى أنبوب مزرعة زجاجي لمدة ساعة إلى ساعتين من أجل الجوع. ثم حرر الحوريات في قفص يحتوي على نبات أرز مصاب بفيروس قزم الأرز يزرع في أصيص ويسمح للحوريات بالتغذي على نبات الأرز المصاب لمدة يومين. بعد يومين ، انقل هذه الحوريات بعناية إلى قفص جديد يحتوي على شتلات أرز طازجة خالية من الفيروسات ، واسمح للحوريات بالتغذي على شتلات الأرز الخالية من الفيروسات لمدة 12 يوما لإكمال فترة انتقال الدورة الدموية لفيروس قزم الأرز.
لجمع البروتينات اللعابية ، قم بإعداد خمسة أقفاص تغذية صغيرة تشبه الأنابيب مغطاة بشبكة مقاومة للحشرات من أحد طرفيها. بعد حصر 15 إلى 20 نطاط أوراق في كل قفص تغذية ، قم بتغطية الطرف الآخر من القفص بسجادة رغوية رقيقة. ثبت شتلة أرز واحدة بين نهاية القفص وحصيرة رغوية بأشرطة ، مما يضمن أن نطاطات الأوراق في قفص التغذية يمكن أن تتغذى على شتلات الأرز المعرضة لداخل القفص.
اغمر جذور الشتلات في الماء حتى يبقى نبات الأرز على قيد الحياة ، واترك نطاطات الأوراق تتغذى عليها لمدة يومين. بعد يومين ، قم بإزالة نطاطات الأوراق من أقفاص التغذية الخاصة بهم واجمع شتلات الأرز التي تتغذى عليها نطاطات الأوراق. قطع الشتلات خارج القفص واستعادة مناطق تغذية الشتلات.
قم بإعداد 1x Tris-Glycine buffer عن طريق تخفيف 200 مل من المخزن المؤقت 5x المحضر مع 800 ملليلتر من الماء المعقم. ثم قم بإعداد 10x TBS buffer والأوتوكلاف الحل عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت لعينة البروتين 4x.
ثم قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل عن طريق خلط 800 ملليلتر من المخزن المؤقت Tris-Glycine مع 200 ملليلتر من الميثانول. أخيرا ، قم بإعداد محلول TBST بإضافة 100 ملليلتر من 10x TBS وثلاثة ملليلتر من Tween 20 إلى 900 ملليلتر من الماء المعقم. للكشف عن البروتينات اللعابية والفيروسية ، قم بطحن 0.1 جرام من عينات الأرز بالنيتروجين السائل حتى يصبح النسيج مسحوقا.
ثم أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة البروتين 4x إلى العينة واغلي لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي العينات ونقل الطافية إلى قارورة جديدة. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة على جل SDS-PAGE وقم بتشغيلها في مخزن مؤقت Tris-Glycine عند 150 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة.
أثناء تشغيل الجل ، ضع غشاء نيتروسليلوز 0.45 ميكرون ومستلزمات شطيرة أخرى في مخزن النقل المؤقت لمدة 30 دقيقة. بعد الجري ، قم بوضع شطيرة الجل ونقله لمدة 90 إلى 120 دقيقة عند 100 فولت في المخزن المؤقت للنقل. بعد اكتمال النشاف ، ضع الغشاء في محلول مانع للحليب الجاف 7٪ منزوع الدسم في TBST واحتضانه لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، أضف جسما مضادا ضد فيروس قزم الأرز P8 أو vitellogenin واحتضان الغشاء لمدة ساعتين أو طوال الليل. بعد الحضانة ، اغسل الغشاء باستخدام TBST ثلاث مرات مع حضانة لمدة خمس دقائق بين كل غسلة. ثم أضف الماعز المضاد للأرانب IgG كجسم مضاد ثانوي واحتضان الغشاء لمدة 60 إلى 90 دقيقة.
استخدم مجموعة ECL Western للكشف الكيميائي في كواشف الكشف المختلطة واحد واثنان في المجموعة بنسبة واحد إلى واحد. ضع الغشاء على الكاشف المختلط واحتضان اللطخة لمدة خمس دقائق. استنزاف الكاشف الزائد والتقاط صورة كيميائية ولونية للغشاء.
الجمع بين الصور لرؤية هذا الأخير مع عصابات البروتين. أظهر تحليل اللطخة الغربية للكشف عن vitellogenin نطاقات محددة ومتوقعة من حوالي 220 كيلو دالطن في تغذية نباتات الأرز والغدد اللعابية للحشرات. في المقابل ، لم يلاحظ أي شريط في النباتات غير التغذية ، مما يشير إلى إطلاق فيتلوجينين في مضيف النبات كبروتين لعابي.
أظهر تحليل اللطخة الغربية للكشف عن بروتين P8 لفيروس قزم الأرز نطاقا محددا ومتوقعا يبلغ حوالي 46 كيلودالطن في النباتات المغذية وأجسام الحشرات الخبيثة. في المقابل ، لم يلاحظ أي شريط في النباتات غير المغذية وأجسام نطاط الأوراق غير الخبيثة ، مما يثبت أنه يمكن أيضا اكتشاف البروتينات الفيروسية في النباتات المغذية. يجب أن يؤخذ في الاعتبار التحميل الفيروسي في نطاطات الأوراق وتوقيت الكشف والنسخ المتماثلة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.
يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة البعوض الذي ينقل الفيروسات المنقولة بالمفصليات.
