يوفر بروتوكولنا سير عمل مبسطا لترجمة النسخ الخالية من الخلايا Streptomyces venezuelae. يسخر نظامنا الإنزيمات والمسارات الأيضية من هذا الكائن غير النموذجي. المزايا الرئيسية هي التعبير غير المتجانس للجينات ذات المحتوى العالي من GC ، وتوفير بيئة مواتية لإعادة توجيه البروتين ، ونظام مفتوح لضبط مسارات التخليق الحيوي.
ستفتح طريقتنا فرصا جديدة لدراسة العقديات والبكتيريا عالية GC ذات الصلة. يسمح بدراسة الإنزيمات والتعبير الجيني في هذه البكتيريا. تم تطوير هذه التقنية لسهولة التنفيذ من قبل المستخدمين الجدد.
الخطوة الوحيدة التي تتطلب خبرة أو معرفة سابقة هي الصوتنة لإنتاج مستخلصات خام نشطة للغاية. لبدء حصاد الخلايا المستزرعة مسبقا في اليوم الثالث ، قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها بنسبة واحد إلى 10 مع وسط GYN طازج للكثافة البصرية أو قياس OD عند 600 نانومتر. إذا كان OD للثقافة عند 600 نانومتر أقل من 0.3 ، فقم بزيادة سرعة الاهتزاز إلى 250 إلى 300 دورة في الدقيقة وتنمو حتى يصل OD إلى 0.3.
تنمو لمدة لا تزيد عن ساعتين إضافيتين. إذا كان OD أكبر من 0.3 ، فقم بنقل الثقافات إلى حاويات الطرد المركزي وتبرد بسرعة على الجليد الرطب لمدة 30 دقيقة. أثناء انتظار أن تبرد مزرعة الخلايا ، قم بإعداد أربعة ملليلترات من ديثيوثريتول مولي واحد طازج ، S30A و S30B المخازن المؤقتة واحتفظ بها على الجليد.
بعد وزن أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 ملليلتر ، قم بتبريده مسبقا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف مليلترين من ديثيوثريتول مولي واحد إلى لتر واحد من المخزن المؤقت S30A على الثلج واخلطه جيدا. جهاز طرد مركزي للخلايا عند 6000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من المادة الفائقة في حركة سريعة ، أضف 250 ملليلتر من المخزن المؤقت S30A وأعد تعليق الخلايا عن طريق هز زجاجات الطرد المركزي بقوة حتى يتم تشتيت كتل الخلايا بشكل متجانس. ثم قم بطرد الخلايا مرة أخرى لمدة ست دقائق. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة وكرر إضافة المخزن المؤقت S30A ، متبوعا بالطرد المركزي كما هو موضح.
بعد ذلك ، أضف ملليلترين من DTT مولي واحد إلى لتر واحد من المخزن المؤقت S30B على الثلج واخلطه جيدا. أضف 250 ملليلتر من المخزن المؤقت S30B إلى الخلايا وكرر الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت S30B وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر المبرد مسبقا.
إذا لزم الأمر ، انقل الخلايا المتبقية مع خمسة إلى 10 ملليلترات إضافية من المخزن المؤقت S30B واملأ الأنبوب إلى حجم 50 ملليلتر باستخدام S30B. جهاز طرد مركزي للخلايا لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الفائقة وكرر الطرد المركزي في الإعدادات السابقة كما هو موضح.
بعد التخلص من المادة الفائقة ، قم بشفط المادة الفائقة S30B المتبقية باستخدام ماصة 100 إلى 200 ميكرولتر وقم بوزن حبيبات الخلايا الرطبة. لكل غرام واحد من الخلايا الرطبة، أضف 0.9 ملليلتر من المخزن المؤقت S30B. أعد تعليق الخلايا باستخدام إما ماصة باستور أو دوامة.
جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 10 ثوان حتى 500 غرام لترسيب الخلايا. اخفض طرف الصوتة في تعليق الخلية حتى يصبح الطرف حوالي سنتيمتر واحد تحت سطح السائل. أدخل معلمات مختلفة في إعدادات الصوتة.
اضبط التردد على 20 كيلوهرتز ، والسعة إلى 65٪ من وقت النبض وإيقافه إلى 10 ثوان ، وإجمالي وقت الصوتنة إلى دقيقة واحدة. ابدأ الصوتنة وحرك الأنبوب لأعلى أو لأسفل وجانبيا خلال أول دورتين للراحة لضمان صوتنة الخلايا بالتساوي. إذا لم يتم تحلل الخلايا بالكامل ، فقم بقلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات وكرر الصوتنة لدورة أو دورتين إضافيتين مدتهما 10 ثوان مع الخلط المتكرر حتى تتعطل الخلايا بالكامل.
قم بطرد مركزي للخلايا المحللة لإزالة حطام الخلية ، ثم انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر كأليكوت ملليلتر واحد. بالنسبة لتفاعل الجريان السطحي لمستخلصات الخلية ، قم باحتضان الخلية التي تحتوي على مستخلص الخلية عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على كتلة حرارية أو في الحاضنة بدون شاكر. بالنسبة لتفاعل النسخ والترجمة ، قم بإذابة محلول SMM أو MES المستخرج الخلوي والحمض النووي البلازميد على الجليد.
قم بتبريد صفيحة 384 بئرا عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد تفاعل النسخ والترجمة على الجليد حيث يكون 25٪ من الحجم هو الحمض النووي البلازميد ، و 33.33٪ هو مستخلص الخلية و 41.67٪ هو محلول SMM. قم بتدوير الخليط بلطف لمدة خمس ثوان تقريبا عند إعداد سرعة منخفضة لضمان تجانس المحلول مع تجنب الرغوة أو تكوين الفقاعات.
انقل ثلاثة أليكوتات من 10 ميكرولترات إلى ثلاثة آبار من صفيحة 384 بئرا كثلاثي تقني دون إدخال فقاعات الهواء. بعد إغلاق اللوحة بغطاء شفاف ، قم بتدوير اللوحة عند 400 مرة G لمدة خمس ثوان واحتضان التفاعل عند 28 درجة مئوية إما في حاضنة أو قارئ لوحة دون اهتزاز. تم تحسين ترجمة النسخ الخالية من الخلايا العقدية الفنزويلية للتعبير عالي الإنتاجية عن البروتينات الفلورية من البلازميد القياسي pTU1-A-SP44 ، بالإضافة إلى إنزيمات التخليق الحيوي التي تم اكتشافها بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي.
تم قياس تعبير البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I باستخدام عدة طرق. تم إجراء قياسات التألق في الوقت الفعلي ل mRNA باستخدام dBroccoli RNA aptamer ، وبروتين mScarlet-I غير الناضج باستخدام نظام علامة FlAsH ، وبروتين mScarlet-I الناضج. تم إجراء تلطيخ التألق في الجل ل mScarlet-I باستخدام علامة FlAsH بالإضافة إلى تلطيخ Coomassie Blue للبروتين الكلي الخالي من الخلايا.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء اختبارات النشاط لدراسة الإنزيمات والمسارات التي تمثل تحديا باستخدام الطرق القياسية. كما يمتد نحو التخليق الحيوي الموسع والتعبير الجيني عالي الإنتاجية. نحن نعمل على تطوير هذه التقنية لدراسة الإنزيمات الأيضية من البكتيريا عالية GC.
لقد أظهرنا قدرة نظامنا على دراسة التخليق الحيوي الموسع في التفاعلات الخالية من الخلايا.
