توفر الميتوكوندريا الطاقة الخلوية من خلال الفسفرة التأكسدية التي تساهم في جميع العمليات داخل الخلية تقريبا. وبالتالي ، ترتبط اختلالات الميتوكوندريا بمجموعة واسعة من الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القياس في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية الميتوكوندريا عن طريق استهلاك الأكسجين ، وبالتالي ، تقييم دقيق لإجمالي استقلاب الطاقة الخلوية.
يسمح قياس التنفس عالي الدقة بإجراء تقييم مباشر لما يفشل في نظام الفسفرة التأكسدي ، مما قد يوفر أدلة تشخيصية في أمراض الميتوكوندريا الأولية واختلالات الميتوكوندريا الثانوية المرتبطة بالعديد من الاضطرابات. سيوضح الإجراء ريان عوضبرساد ، طالب الدكتوراه في مختبري. للبدء ، قم بإجراء معايرة الأكسجين عن طريق تشغيل أجهزة قياس التنفس في 2.1 ملليلتر من وسط التنفس الميتوكوندريا عند 37 درجة مئوية لأكثر من 45 دقيقة والمتابعة إذا كان التباين الأساسي في حدود أربعة بيكومولات في الثانية.
زراعة خلايا HEK293 في DMEM عالية الجلوكوز تستكمل مع 10٪ FBS المنشط بالحرارة ، GlutaMAX ، الأحماض الأمينية غير الأساسية ، بيروفات الصوديوم ، ويوريدين في حاضنة عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في يوم التجربة ، قم بجمع الخلايا وعدها وإعادة تعليق 2.5 مليون خلية في وسط تنفس 2.5 ملليلتر. لتقييم التنفس الروتيني ، أضف 2.3 ملليلتر من تعليق الخلايا المتوسطة للتنفس الدافئ إلى الغرفة.
قم بتشغيل الغرف عند 37 درجة مئوية وسرعة تحريك تبلغ 700 دورة في الدقيقة. انتظر لمدة ثلاث دقائق على الأقل للسماح للوسائط بتفريغ الغاز، ثم أغلق الغرف عن طريق لف السدادة في حركة دوارة. بعد ذلك ، استنشق السائل الزائد أعلى السدادة.
بعد 10 دقائق، احصل على إشارة تدفق أكسجين مستقرة لتسجيل التنفس الروتيني أو الحالة الأولى. لإجراء تحليل OXPHOS في الخلايا السليمة ، أضف ميكرولترين من 0.01-millimolar oligomycin للحصول على تركيز نهائي من 10-nanomolar. معايرة FCCP من مخزون اثنين من الملليمولات عن طريق إضافة 0.6 ميكرولتر في خطوات 0.2 ميكرولتر حتى لا يتم ملاحظة أي زيادة في التنفس والتنفس غير مقترن إلى أقصى حد.
بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من روتينون مللي مولا واحد للحصول على تركيز نهائي من 0.5-micromolar. ثم ، أضف ميكرولترين من ملليغرام واحد لكل مخزون مضاد للمايسين ملليلتر للحصول على تركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل ملليلتر. أعد أكسجة الغرفة إلى نفس مستوى الأكسجين ، حوالي 150 ميكرومولار ، عن طريق رفع المكبس.
بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من الأسكوربات المولي 0.8 للحصول على تركيز نهائي من اثنين من الملليمول. ثم ، أضف على الفور خمسة ميكرولترات من TMPD 0.2-molar للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 ملليمولار وتقييم النشاط الوريدي المعقد. عندما يتم الوصول إلى ذروة تدفق الأكسجين باستخدام TMPD ، أضف خمسة ميكرولترات أو أزيد رباعي الأضواء للحصول على تركيز نهائي من 10 ملليمول.
بعد ذلك ، استمر في الجري لمدة خمس دقائق على الأقل لفحص الأكسدة التلقائية ل TMPD لحساب المستوى الأساسي IV المعقد. بعد الجري ، اجمع ملليلتر واحد من تعليق العينة من كل غرفة وأجهزة الطرد المركزي عند 1،000 غرام للخلايا المتخلل أو عند 20،000 غرام لتحلل الأنسجة. ثم ، تخلص من supernatant وتجميد الكريات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من التحليل في المصب.
أولا ، زرع الخلايا وفقا لمعدلات نمو خطوط الخلايا الفردية. تمييع الأوليغومايسين ، FCCP ، الروتينون ، ومضاد المايسين في ثلاثة ميكرولترات من الفحص متوسط إلى تركيز نهائي من 1.5-micromolar ، 1.125-micromolar ، و micromolar واحد ، على التوالي. في وقت لاحق ، املأها في منافذ منفصلة.
راقب منافذ الحقن لضمان تحميل متساو للعينات. قم بتشغيل النظام القائم على الصفائح الدقيقة والكمبيوتر وقم بموازنتهما عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات على الأقل. في يوم الفحص القائم على الصفائح الدقيقة ، تحقق من التقاء صفيحة زراعة الخلايا ، ومورفولوجيا الخلايا ، وتأكد من أن آبار الخلفية فارغة.
ثم ، قم بإزالة كل شيء باستثناء 20 ميكرولتر من وسط الثقافة من كل بئر. ثم اغسل كل بئر ب 90 ميكرولتر من متوسط الفحص وأضف 100 ميكرولتر من متوسط الفحص لجعل الحجم النهائي يصل إلى 120 ميكرولتر. بعد ذلك ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة.
بعد استرداد اللوحة من الحاضنة ، قم بإزالة الغطاء ووضع اللوحة الدقيقة في الفتحة. انقر فوق متابعة لبدء التشغيل. بعد الانتهاء من الجري ، أخرج اللوحة وأزل وسائط الفحص المتبقية دون إزعاج الخلايا.
ثم ، قم بتجميد اللوحة بأكملها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد إجراء تجارب الديجيتونين للترقي والتنفس ، تم تسجيل آثار استهلاك الأكسجين الخام لخلايا HEK293 من النوع البري وخلايا HEK293 مع ضربة قاضية جينية بوساطة كريسبر مما أدى إلى نقص OXPHOS متعدد. تم الحصول على آثار استهلاك الأكسجين المتراكبة التي تم إدخالها بشكل طبيعي.
تظهر CRISPR Knockout 1 ضعف التنفس ولا تظهر CRISPR KNOCKOUT 2 أي تنفس مقارنة بالنوع البري عند تطبيعها إلى رقم الخلية. تم تحديد كميات البروتين كميا وتم تطبيع قيم التنفس إلى كمية البروتين من أجل تحديد القيم المطلقة لحالات الجهاز التنفسي ونسب التحكم في التدفق ذات الصلة. تم العثور على معدلات التحمض خارج الخلية لزيادة نقص OXPHOS في CRISPR KNOCKOUT 2 ، مما يشير إلى تعويض نقص الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا في خلايا HEK293 من خلال زيادة تحلل السكر.
بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد قيم التنفس في وجود oligomycin، FCCP، و rotenone، وتم تطبيع القيم التي تم الحصول عليها إلى كمية البروتين. تمت دراسة آثار استهلاك الأكسجين الطبيعي للبروتين لخلايا HEK293 من النوع البري وخلايا HEK293 مع نقص ترجمة الميتوكوندريا بوساطة كريسبر مما تسبب في نقص OXPHOS متعدد. تم الحصول على آثار استهلاك الأكسجين الطبيعية للأنسجة ذات الوزن الرطب من مخيخ الفأر والعضلات الوحيدة للفأر.
تظهر عضلات النعل ثلاثة أضعاف OXPHOS وقدرة التنفس من المخيخ. مع قياس التنفس القائم على الغرفة ، من المهم العمل بسرعة ، حيث ستنخفض وظيفة الميتوكوندريا في اللحظة التي تجمع فيها عيناتك ، ومع قياس التنفس القائم على الصفائح ، من الأهمية بمكان الحصول على كثافة بذر مثالية لتقليل التباين. لمزيد من التحليل ، يمكن تحديد كمية البروتين أو النشاف المناعي.
هذا يمكن أن يحدد ما إذا كان التغيير في وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا يرجع إلى وفرة مجمعات OXPHOS أو كمية الميتوكوندريا. بالفعل قبل قرن من الزمان ، تم العثور على خلايا سرطانية لإجراء تحلل السكر اللاهوائي بالإضافة إلى OXPHOS الميتوكوندريا. وهذا يؤكد الحاجة إلى فحص الطاقة الحيوية للميتوكوندريا.
هنا أظهرنا اثنين من مقاييس التنفس التي تعتبر المعيار الذهبي اليوم.
