يعد امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي ضروريين لمواصفات الأرومة العظمية والتمايز وتكوين العظام. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وحساسة لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية. يستخدم بروتوكولنا الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية لتحديد كمية امتصاص الأحماض الأمينية.
إنها طريقة رخيصة وحساسة وسريعة يمكن تعديلها بسهولة لظروف مختلفة. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتقييم امتصاص العناصر الغذائية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية مثل الجلوكوز والأحماض الدهنية في مجموعة متنوعة من الأنسجة وكذلك الخلايا الأولية أو المحولة. لبدء امتصاص الأحماض الأمينية لوحة فحص خمس مرات 10 إلى خلايا ST2 الرابعة في كل بئر من 12 بئر لوحة زراعة الأنسجة في ألفا ميم المتوسطة مع استكمال FBS والبنسلين والستربتومايسين.
لوحة آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلايا لكل شرط للتطبيع. بعد ذلك ، احتضن الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى التقاء. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا مرتين بملليلتر واحد من PBS عند درجة الحموضة 7.4.
ثم قم بشفط PBS قبل غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام HEPES أو KRH الخاص ب Krebs-Ringer بملليلتر واحد. احتضان الخلايا مع 0.5 ملليلتر من KRH الطازجة التي تحتوي على أربعة ميكروكوري لكل ملليلتر L34 وسائط عمل الجلوتامين المثلثة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بجمع الوسط المشع لتوزيعه في حاوية النفايات السائلة.
ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات بالثلج البارد KRH لإنهاء التفاعل. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 1٪ إلى كل بئر وقم بتريل الخليط 10 مرات لتحليل الخلايا وتجانسها. ثم انقل الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وقم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10000 جم لمدة 10 دقائق.
انقل الفائق إلى قارورة تلألؤ تحتوي على ثمانية ملليلترات من محلول اللمعان، واقرأ نشاط الراديو والعد في الدقيقة باستخدام عداد اللمعان. من الصفائح غير المشعة المتبقية من الخلايا ، التربسين ، إنعاش ، وحساب الخلايا لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس الدم، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية.
لتحديد امتصاص الأحماض الأمينية ، اطرد النخاع من العظم قبل وزن عمود العظام. لإزالة الخلايا من العظم ، قم بغلي عظم العضد في PBS عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بموازنة كل من هوميري الحي والمغلي في ملليلتر واحد من KRH لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، احتضن عظام التحكم التجريبية والمسلوقة بشكل منفصل في KRH الطازج الذي يحتوي على أربعة ميكروكاري لكل ملليلتر L234 ثلاثي الأرجينين لمدة تصل إلى 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الوسط المشع ، قم بإنهاء التفاعل عن طريق غسل عظم العضد ثلاث مرات بملليلتر واحد من KRH البارد الجليدي. انقل كل عظمة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 500 ميكرولتر من RIPA Buffer.
ثم قم بتجانس عظم العضد و RIPA Buffer عن طريق التقطيع 100 مرة بالمقص ، يليه صوتنة بسعة 35٪ ونبضة ثانية واحدة لمدة 10 ثوان. توضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10،000 مرة G في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 200 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير تلألؤ تحتوي على ثمانية ملليلترات من محلول اللمعان.
اقرأ النشاط الراديوي باستخدام عداد اللمعان. تم تقييم الخصائص الحركية لامتصاص الجلوتامين المثلث L34 في المختبر وخلايا ST2 المتقاربة في وجود أو عدم وجود حمض إيزوبوتيريك أميني ميثيل الصوديوم أو الليثيوم. أدت إزالة الصوديوم إلى انخفاض بنسبة 90٪ في امتصاص الجلوتامين.
أدى وجود الليثيوم إلى زيادة امتصاص الجلوتامين بنسبة 2٪ مقارنة بالحالة الخالية من الصوديوم. في حين أن حمض الميثيل الأميني إيزوبوتيريك لم يؤثر على امتصاص الجلوتامين. وتشير النسبة المئوية التقديرية لمساهمات النظام A أو N أو L أو ASC وغاما زائد L إلى أن معظم امتصاص الجلوتامين يتم بوساطة الأنظمة ASC و gamma plus L.System N مسؤول عن امتصاص الجلوتامين المعتمد على الصوديوم بنسبة 2٪ تقريبا.
وأظهر النظام A مساهمة واستيعابا بنسبة 0٪. تم تحليل امتصاص الأرجينين المثلث X-VIVO L34 في هوميري حديثي الولادة المسلوق والحي على مدار ساعتين من الزمن. زاد امتصاص أرجينين خطيا طوال التجربة وعاش هوميري.
لم يظهر هوميري المسلوق زيادة ديناميكية في امتصاص الأرجينين في التجربة. يظهر التحليل التمثيلي امتصاص الأرجينين الطبيعي والمصحح. من المهم غلي العظم المقابل كعنصر تحكم نشط.
هذه الخطوة ضرورية لأن مصفوفة العظام قد تمتص الأحماض الأمينية المشعة ، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقة. وقد سمح لنا البروتوكول بتأكيد حركية امتصاص الأحماض الأمينية في المختبر وفي الجسم الحي.
