يسمح لنا هذا البروتوكول بزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في ظروف تحاكي عن كثب الخصائص في الجسم الحي. باستخدام تقنية فرز الخلايا المغناطيسية ، يسمح لنا بروتوكولنا بتحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة يومين فقط في المختبر ، دون استخدام أي مصل في وسط الثقافة. للبدء ، استخدم مقصا صغيرا لقطع الجلد من الرقبة إلى الأنف ، بعد الخيط السهمي من 15 إلى 20 ملم.
أدخل النصائح مع الثقبة ماغنوم موازية للجمجمة. قطع من كل جانب إلى العينين. قطع بين العينين بمقص صغير لفصل الجمجمة والدماغ عن الرأس.
باستخدام ملقطين ، أمسك الجمجمة بالقرب من المصابيح الشمية ، وقم بتمزيق الجمجمة بعناية. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بإزالة المخيخ والمصباح الشمي ، وقطع الدماغ إلى قطعتين. ضع قطع الدماغ في طبق بتري يحتوي على 40 ملليلتر من HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
تحضير خليط التفكك وفقا لهذا الجدول. انقل 12 قطعة دماغية إلى أنبوب C بوزن إجمالي يبلغ 1.2 جرام لكل أنبوب تفكك. ثم ضع أنابيب C على جهاز فك الارتباط مع التدفئة.
بدء تشغيل برنامج NTDK الأمثل في الانفصال. جهاز طرد مركزي لمدة 20 ثانية. أكمل التفكك الميكانيكي عن طريق السحب ثلاث مرات.
نقل الخلايا إلى أربعة أنابيب 15 ملليلتر مع مصافي المرفقة. شطف المصافي مع 10 ملليلتر من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، وإزالة الطافت مع ماصة 10 ملليلتر.
أضف بعناية 10 ملليلتر من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، وأعد تعليق الحبيبات. مرة أخرى ، الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بستة ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز.
كرر الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول حبة الميكروبيدات CD11b واحتضان الأنابيب لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، أعد تعليق الحبيبات بستة ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز.
كرر الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات بثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز. بعد ذلك ، اتبع برنامج Possel على الفاصل لإعداد ثمانية أعمدة. مرر الخلايا عبر العمود عن طريق إضافة ملليلتر واحد من معلق الخلية في المرة الواحدة.
مع ملليلتر واحد من العازلة للفرز ، قم بالتخلص من الخلايا الإيجابية CD11b على لوحة شطف معقمة. تجمع الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر. الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه مع 10 ملليلتر من وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة.
عد الخلايا الموجبة CD11b. أعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة للحصول على تركيز نهائي من 650،000 إلى 700،000 خلية لكل ملليلتر. الاستغناء عن التعليق في لوحات زراعة الخلايا.
احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط الخلايا الدبقية الصغيرة المسخن مسبقا ، وكرر الحضانة بين عشية وضحاها. تحفيز الخلايا قبل هذه الخطوة ، وإجراء اختبار البلعمة خلال الساعات الثلاث الأخيرة من التحفيز.
احسب عدد الخرز وفقا لهذا الجدول بنسبة 50 حبة لكل خلية. تحضير خليط الخرز. احتضان الأنبوب لمدة ساعة واحدة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
دوامة كل 10 دقائق. لكل بئر ، أضف الحجم المحسوب لمحلول الخرزة واحتضانه لمدة ثلاث ساعات. باستخدام هذا النهج ، تم تقييم نشاط البلعمة للخلايا الدبقية الصغيرة بعد التحفيز بواسطة عوامل مؤيدة للالتهابات ، مثل إنترلوكين -1 بيتا ، بالإضافة إلى إنترفيرون جاما ، أو عديدات السكاريد الدهنية.
بعد التحفيز لمدة ست إلى 24 ساعة ، تم تحليل حبات الخلايا الدبقية الصغيرة Cy3 الفلورية بواسطة المجهر متحد البؤر. بعد ست ساعات ، تبدأ الخلايا الدبقية الصغيرة في ظهور حبات Cy3 البلعمية فقط تحت حالة إنترلوكين -1 بيتا بالإضافة إلى إنترفيرون جاما. بعد 24 ساعة ، كانت هناك زيادة في مضان Cy3 لكلا النوعين من التحفيز ، مما يسلط الضوء على زيادة نشاط البلعمة.
تم رفع نقاء ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، والذي أظهر زيادة في صلاحية الخلية بعد الفرز. تم تحليل استخدام قياس التدفق الخلوي وعلامات تعداد خلايا RT-qPCR قبل وبعد فرز الخلايا الإيجابية CD11b من أدمغة الفئران في اليوم الثامن بعد الولادة. ميزت هذه التحليلات مجموعات مختلفة من خلايا الدماغ ، مثل CX3CR135 للخلايا الدبقية الصغيرة ، O4 ، أو OLIG2 للخلايا قليلة التغصن ، أو NeuN ، أو synaptophysin ، للخلايا العصبية ، و ACSA-2 ، أو GFAP للخلايا النجمية.
بعد فرز الخلايا باستخدام الجسم المضاد CD11b ، تم الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة فقط. من المهم أن ماصة بلطف شديد أثناء إضافة التعليق إلى العمود لمنع الانسداد وتجنب موت الخلايا الميكانيكية. بعد هذه الطريقة ، يمكن إجراء البروتينات النسخية ، مثل الدم الغربي ، أو Luminex ، وحتى الكيمياء المناعية من أجل رؤية تأثير التحفيز الدبقي الصغير.
