يوفر هذا البروتوكول منهجية قوية لتحليل المركبات الكهربائية على المستوى الخلوي، ونهجا عمليا لامتصاص EV الفعال وتحليل تتبع EV. هذه الطريقة من وضع العلامات EV يزيل هطول الأمطار المشترك من المركبات الكهربائية وصبغ، وبالتالي تعزيز إشارات EV. يتم قياس امتصاص EV من خلال التحليل الحجمي لتمييز المركبات الكهربائية الداخلية عن المركبات الكهربائية السطحية.
المركبات الكهربائية هي البضائع النشطة، وبالتالي، فإن امتصاصها يسمح بنقل الجزيئات الكيميائية الحيوية. للبحث في تسليم الأدوية القائمة على EV وعلاج السرطان، يمكن أن تكون هذه التقنية أداة تقييم. يلعب امتصاص EV دورا في التواصل بين الخلايا ويتم التحقيق فيه في مختلف مجالات البحث ، مثل بيولوجيا السرطان وعلم الأعصاب وتوصيل الأدوية.
من المحتمل أن يسهل هذا البروتوكول إجراء فحص امتصاص EV فعال. لعزل الحويصلات خارج الخلية، أو المركبات الكهربائية، قم بحقن ملليلتر واحد من وسائط ثقافة الخلايا المعالجة مسبقا في غرفة العينة لجهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي. لتشغيل الجهاز، قم بتدوير الجهاز في جهاز الغزل على سطح المقعد عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
بعد الغزل، قم بإزالة السائل من غرفة النفايات عن طريق الأنابيب أو القرصنة، ثم كرر هذا الإجراء مرتين لمعالجة ملليلترين إضافيين من وسائط ثقافة الخلية. بعد ذلك ، لغسل المركبات الكهربائية المعزولة ، قم بحقن ملليلتر واحد من PBS في غرفة العينة وتدور الجهاز في آلة الغزل benchtop. بالنسبة للوسم المناعي للمركبات الكهربائية، قم بحقن ميكروجرام واحد لكل ملليلتر من الجسم المضاد الخاص EV في ثقب الوضوء للجهاز الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المعزولة.
ثم احتضان لمدة ساعة واحدة في الظلام على شاكر لوحة لضمان التوزيع حتى من الأجسام المضادة عبر العينة. بعد ذلك، إرفاق شريط لاصق إلى ثقب elution. حقن ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في غرفة العينة لغسل الأجسام المضادة المتبقية، ثم تدور الجهاز حتى غرفة العينة فارغة.
كرر الغسيل عن طريق حقن ملليلتر آخر من PBS في غرفة العينة ، وغزل الجهاز كما هو موضح سابقا. بعد إزالة السائل المتبقي من الغرفة، ماصة المركبات الكهربائية المسمى fluorescently من غرفة الغشاء إلى أنبوب العنبر أو أنبوب صغير. حماية الأنبوب من الضوء حتى الاستخدام.
البذور أربع مرات 10 إلى خلايا PC3 الرابعة في طبق 35 ملليلتر مع وسائط ملليلتر واحد. السماح للخلايا بالالتصاق بين عشية وضحاها في ظروف زراعة الخلايا المثلى. في اليوم التالي، اغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام وسائط مستنفدة للاكسوسوم.
بعد تمييع المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية إلى التركيز المناسب باستخدام الوسائط المستنفدة للاكسوسوم ، أضف المركبات الكهربائية المخففة إلى الخلايا المستهدفة الملتزم بها واحتضن الوقت التجريبي المطلوب. بعد إزالة المركبات الكهربائية غير الداخلية عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام الخالية من الإكسوسوم، تسمية السيتوبلازم من الخلايا الملتزم بها مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من CMTMR، واحتضان في ظروف ثقافة الخلايا الأمثل. لتصوير الخلايا الحية، ضع الخلايا المعدة في حاضنة على خشبة المسرح.
بعد وضع معلمات التصوير على أساس عينات التحكم، حدد عمق الخلايا المستهدفة ونطاق حجم التراص في اتجاه Z للحصول على صور confocal ثلاثية الأبعاد، ثم قم بتعيين الحصول على الصورة إلى صور متعددة مكدسة من كل من الصبغة الخاصة بالخلايا والصبغة الخاصة EV في وقت واحد. لمعالجة الصور ، واستخدام برنامج معالجة الصور التلقائي. لبناء الأسطح الظاهرية للخلايا، انقر على إضافة أسطح جديدة.
لتكوين أسطح الخلايا الظاهرية، انقر فوق الزر إضافة وحدد الجودة كنوع عامل التصفية. عتبة القيمة المناسبة للحد الأدنى عن طريق الفحص البصري، تعيين القيمة القصوى للحد الأعلى، وانقر فوق الزر إنهاء التالي، لبناء النقاط الظاهرية من المركبات الكهربائية، انقر فوق الزر إضافة بقع جديدة. ضمن إعدادات الخوارزمية، حدد أحجام مختلفة لأماكن العمل وأقصر حساب للمسافات، ثم انقر فوق التالي وحدد القناة 1 Alexa Fluor 488 كقناة مصدر.
أدخل القيمة المناسبة لقطرة XY المقدرة ضمن الكشف الموضعي وانقر فوق التالي. لتكوين نقاط EV الظاهرية، انقر فوق الزر إضافة وحدد الجودة كنوع عامل التصفية. تعيين الحد الأدنى بواسطة فحص مرئي ثم انقر فوق التالي لنوع المناطق الموضعية حدد كثافة مطلقة ثم انقر فوق التالي.
لتحديد عتبة منطقة نقاط EV، أدخل القيمة المناسبة ل عتبة المنطقة عن طريق الفحص البصري. حدد القطر من أسفل حجم المنطقة وانقر فوق إنهاء. لتقسيم البقع المجمعة داخل السطح المبني، انقر على نقاط البناء واذهب إلى الفلاتر.
انقر بعد ذلك على زر إضافة وحدد أقصر مسافة إلى Surfaces، Surfaces Surface 1 كنوع عامل التصفية. بعد تعيين الحد الأدنى للحد الأدنى والقيمة المناسبة للحد الأعلى، انقر فوق المقطع مكررة إلى الزر البقع الجديدة. لحساب تلقائي للمركبات الكهربائية داخل الخلايا، انقر فوق تحديد البقع 1، انتقل إلى الإحصاءات، وتصدير القيمة من إجمالي عدد البقع.
للحصول على عدد الخلايا، انقر فوق "السطوح المبنية 1"، ثم انتقل إلى "الإحصائيات" وتصدير قيمة إجمالي عدد الأسطح من "إجمالي". وأخيرا، انتقل إلى علامة التبويب مفصلة ضمن الإحصاءات لتصدير وحدة التخزين. وصفت المركبات الكهربائية المعزولة عن وسائط ثقافة الخلايا PC3 باستخدام جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي بجسم مضاد خاص ب EV مترافق مع الفلورو-4، وتم تصورها باستخدام المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد.
تم تصور المركبات الكهربائية الداخلية على أنها puncta ويسمح EV.Post الفردية لهذه الصور بالتصور والتحديد الكمي لعملية استيعاب EV في الخلايا. تشير نتائج فحص امتصاص EV إلى أن مستوى امتصاص EV يعتمد على طول فترة الحضانة. يمكن تسوية عدد المركبات الكهربائية الداخلية إلى حجم الخلية المتلقي لتحديد المعدل الفعلي لامتصاص EV للخلية المحددة.
يسمح هذا الإجراء بالاستبعاد المنهجي للمركبات الكهربائية غير الداخلية لقياس عدد المركبات الكهربائية الداخلية بدقة. يظهر هنا توزيع حجم نقاط EV الداخلية. وبالتالي فإن الخطوات الرئيسية هي استخدام الجهاز microfluidic لوضع العلامات EV ، والتقليل من مضان الخلفية عند تصور المركبات الكهربائية الفلورية ، ومن ثم تحليل ما بعد التصوير لتحديد المركبات الكهربائية الداخلية مقابل السطحية.
لذلك يمكن إجراء تتبع EV داخل الخلايا في الوقت الحقيقي على مستوى ثلاثي الأبعاد ، بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق تحليل الاتجار EV على القرارات المكانية / الزمنية والتوطين المشترك للمركبات الكهربائية مع العضيات دون الخلوية. لذلك نعتقد أن هذه التقنية توفر طريقة أسهل وأكثر كفاءة للتحقيق في المركبات الكهربائية داخل المصفوفات داخل وخارج الخلية للباحثين في مجال الاتصالات الخلوية للمركبات الكهربائية.
