يساعد هذا البروتوكول في زراعة البلاعم المشتقة من نخاع العظم من الفئران الناقصة iNOS أو BH4 باستخدام وسائط ومصل محدد بعناية مع مستويات منخفضة من BH4 والنترات لتجنب التداخل مع آليات الأكسدة والاختزال. من خلال التحكم بعناية في مستويات الملوثات المحتملة في عملية الاستزراع ، يمكننا الحد من تداخل أكسيد النيتريك ، وضمان دقة وقابلية تكرار نظام النموذج. تسمح هذه الطريقة بإجراء قياسات دقيقة للبيوبتيرينات، وأكسيد النيتريك، وأي عوامل في اتجاه مجرى النهر تتعلق بهذه المركبات الأساسية.
سيوضح الإجراء الدكتور توماس نيكول ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. للبدء ، ضع الساقين في 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين لغسل أي فرو أو بقايا. ثم ، انقل الساقين إلى طبق بتري بكتريولوجي نظيف ومعقم.
كشط بعناية على طول العظام مع شفرة ، وقطع من خلال الأوتار وإزالة العضلات من العظام. بمجرد تطهير العظام من العضلات ، قم بقطع المشاش في الجزء العلوي من الساق ، أسفل الركبة مباشرة. يمكن قطع الساق في الطرف السفلي ، فوق التقاطع مع الشظية مباشرة.
أخيرا ، قم بقطع المشاش في أي من طرفي عظم الفخذ ، على بعد مسافة قصيرة من مفاصل الركبة والورك. لطرد نخاع العظم ، املأ حقنة 10 ملليلتر ب 10 ملليلتر من PBS وقم بإرفاقها بإبرة. ثم أدخل الإبرة في تجويف النخاع للعظم.
اغسل بلطف مع واحد إلى اثنين ملليلتر من PBS ، وتشغيل الإبرة لأعلى ولأسفل. ثم اسحب التعليق من خمس إلى عشر مرات داخل وخارج حقنة ملليلتر واحدة لتصنيفها. اجمع التعليق في حقنة ملليلتر واحدة ومررها عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلتر.
أخيرا ، ضع العينات على الجليد. لتجميد نخاع العظم للاستخدام في وقت لاحق ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات الحمراء في ملليلترين من مضاد التجمد.
ثم احتضنه عند 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إذا تم تجميده ، فقم بإذابة الجليد عن التعليق بسرعة عند 37 درجة مئوية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم نظيف يحتوي على ثلاثة ملليلترات من وسائط DMEM / F-12.
بعد ذلك ، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في ثلاثة ملليلتر من وسائط DMEM/F-12 المحضرة. عد الخلايا وقم بوضعها في أدوات بلاستيكية غير مغلفة بتقنية TC في وسائط DMEM/F-12 المعدة.
بعد ذلك ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الخامس ، قم بتغذية الخلايا بإضافة 50٪ من الحجم الأصلي لوسائط DMEM / F-12. في اليوم السادس ، قم بتحفيز الخلايا عن طريق إضافة GM-CSF المحضر إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام لكل ميكرولتر مباشرة إلى وسائط زراعة الخلايا.
في اليوم السابع ، قم بإزالة جميع الوسائط من الخلايا. ثم اغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS المسخن مسبقا وأضف وسائط DMEM / F-12 التي تحتوي على 2٪ من السموم الداخلية FBS المنخفضة ، و 1X البنسلين أو الستربتومايسين ، و L-glutamine ، و 25 نانوغرام لكل ميكرولتر M-CSF ، و 50 نانوغرام لكل ميكرولتر GM-CSF. أخيرا ، احتضن الخلايا بين عشية وضحاها في الوسائط لتنشيط البلاعم إلى النمط الظاهري M0.
بالنسبة للنمط الظاهري M1 ، قم بتحفيز الخلايا ب 100 نانوغرام لكل ميكرولتر LPS ، و 10 نانوغرام لكل ميكرولتر IFN-gamma. بالنسبة للنمط الظاهري M2 ، قم بتحفيز الخلايا ب 100 نانوغرام لكل ميكرولتر IL-4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها.
في اليوم الثامن ، تكون الخلايا جاهزة للحصاد أو المعالجة النهائية وفقا لاحتياجات الباحث. الوسائط المكملة بنسبة 10٪ FBS لديها نتريت ورباعي هيدروبيوبتيرين مماثل ، بغض النظر عن M-CSF و GM-CSF ، أو LCM. لكن مستويات البيوبتيرين الإجمالية كانت أعلى في الوسائط المكملة LCM.
ومع ذلك ، لوحظ المزيد من التباين بين دفعات LCM المختلفة. أظهر PCR منتجا للزوج الأساسي 1030 في الفئران من النوع البري ، في حين أنتجت الفئران الضربة القاضية GCH منتجا للزوج الأساسي 1392 ، مما يؤكد استئصال الإكسونات الحرجة. ألغى علاج تاموكسيفين بروتين GCH في الخلايا القاضية.
لا تزال خلايا الضربة القاضية والتحكم تنتج iNOS ، بعد تحفيز LPS و IFN. أظهرت BMDMs المستزرعة من الفئران القاضية GCH المشروطة تضاؤل بشكل كبير في رباعي هيدروبيوبتيرين وانخفاض النتريت. نفس الخلايا المستزرعة في وسائط LCM لم يكن لها تعبير GCH1.
ومع ذلك ، تنتج الخلايا كميات كبيرة من رباعي هيدروبيوبتيرين والنتريت بعد الضربة القاضية. في اليوم الثامن ، لم تكن هناك اختلافات كبيرة في المورفولوجيا بين التحكم غير المنشط و GCH BMDMs بالضربة القاضية بتركيزات مختلفة من تاموكسيفين. تعرض BMDMs الميزات المتوقعة من البلاعم غير المحفزة ، مع خلايا ملتصقة مستديرة وأطراف ممدودة.
عند العمل مع خلية أولية مثل هذه ، من الضروري تعقيم جميع الأنسجة والمعدات بدقة. علاوة على ذلك ، فإن اختيار الوسائط والمكملات المناسبة أمر مهم للحفاظ على بيئة منخفضة من أكسيد النيتريك و BH4. يمكن استخدام كريات الخلايا والوسائط لمختلف التطبيقات النهائية ، مع التركيز على دور أكسيد النيتريك أو البيوبتيرين أو حالة الأكسدة والاختزال الخلوية.
قد تشمل HPLC و qPCR و Western blot ، من بين أمور أخرى.
