لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الضامة ، مثل كيفية توصيف حالة التنشيط في ظل بيئة مختلفة على مستوى البروتين. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر الفرصة للحصول على تعبير مختلف عن العديد من البروتينات في الضامة البشرية باستخدام طريقة القياس الكمي الخالية من التسميات. إثبات الإجراء سيكون ماري مالير وماغالي كورت من مختبري.
للبدء، إضافة 15 ملليلتر من كثافة حل فصل الخلية التدرج في كل من اثنين من أنابيب الطرد المركزي 50 ملليلتر بحيث يمكن أن الحارة الحل إلى درجة حرارة الغرفة قبل تلقي LRSC. وهذا أمر ضروري حيث تعتمد الكثافة على درجة الحرارة. إفراغ LRSC في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.
إضافة 1x برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 ملليلتر ومزيج. ثم، ببطء شديد، إضافة 25 ملليلتر من المزيج على رأس 15 ملليلتر من حل التدرج الكثافة التوازنية. يجب الحرص على عدم خلط المراحل خلال هذه الخطوة.
يجب إضافة الدم على حل التدرج الكثافة دون أي إزعاج لهذه المرحلة. جهاز طرد مركزي كلا أنابيب الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة في 700 G دون فواصل. في نهاية الكثافة الانحدار الطرد المركزي، والطبقات من أسفل إلى أعلى هي كريات الدم الحمراء والميقبتات، وتشكيل بيليه، ومرحلة حل التدرج الكثافة، وطبقة PBMCs، والبلازما المخففة.
مع ماصة، تمر من خلال مرحلة البلازما دون التعرق عليه. ثم، وجمع طبقة PBMC في أنبوب جديد 50 ملليلتر الطرد المركزي. إضافة ما يصل إلى 50 ملليلتر من 1X PBS إلى PBMCs كإعداد الغسيل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 G.Aspirate اكبر و إعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر من وسط الضامة.
بعد صياغة PBMCs في غرفة Malassez ، قم بنقل كمية PBMCs اللازمة لإجراء التجربة إلى أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 300 G.Aspirate اشغال واعادة تعليق بيليه في 80 ميكروليتر من التخزين المؤقت الفرز لكل 10 مليون PBMCs. ثم أضف 20 ميكروليتر من ميكروبات CD14 لكل 10 ملايين PBMCs.
اخلطي جيدا، وحضني لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية تحت الانفعالات المستمرة. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من التخزين المؤقت للفرز لكل 10 ملايين PBMCs كخطوة الغسيل، والطرد المركزي كما كان من قبل. ثم ، الطامح من كبرى وإعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتردات من التخزين المؤقت للفرز لكل 100 مليون PBMCs.
الآن، ضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل. تحضير العمود عن طريق شطفه مع ثلاثة ملليلترات من مخزن الفرز المؤقت. تطبيق تعليق الخلية على العمود.
ثم جمع تدفق من خلال احتواء الخلايا غير المُطلق عليها لتلوين اللاحقة، إذا لزم الأمر. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلترات من مخزن الفرز المؤقت. يجب الحرص على عدم تجفيف العمود الخاص بك.
ثم ضع أنبوب تجميع تحت العمود ثم إزالته من الفاصل. بعد الغسيل، الماصات خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز في العمود. طرد فورا من الخلايا المغناطيسي المسمى عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود.
وأخيراً، كرر هذه الخطوات مع عمود جديد قبل طلاء أحادية و تنفيذ استقطاب الضامة كما هو موضح في بروتوكول النص. الحفاظ على أحادية و الضامة في بيئة تسيطر عليها الأكسجين لإجراء تحليل حالة نقص الأكسجة. استخدام محطة عمل نقص الأكسجة من أجل الحفاظ على الخلايا تحت ضغط الأكسجين الجزئي المطلوب أثناء التجربة.
عند العمل تحت ضغط الأكسجين المنخفض، من المهم إعداد جميع وسائل الإعلام والغسيل العازلة تحت المحطة، والانتظار بما فيه الكفاية للحصول على الضغط الجزئي الصحيح في السائل. تنفيذ تحلل الخلايا في مخزن مؤقت تحت غطاء محرك السيارة المتكيف. تحميل ما يعادل البروتين من 300، 000 خلية لكل عينة على 4-12٪ الكرييلاميد الهلاميد التككرميد.
التحكم في مدة الهجرة الكهربائية للسماح لكل عينة بروتين لتقسيم إلى ستة شرائط هلام كما هو مبين هنا. بعد تحديد وتلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص، ازيلوا من نطاقات البروتين بمشرط نظيف. النرد كل الفرقة استئصال قبل وضعها في 500 أنابيب ميكروليتر.
الآن، غسل شرائح هلام ثلاث مرات في 200 ميكرولتر من 25 ميليمولاري بيكربونات لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، والتخلص من بيكربونات الأمونيوم بين كل خطوة. اتبع هذا مع غسل واحد في 25 ميليمولار بيكربونات و acetonitrile. ثم، وتجفيف القطع هلام مع 200 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونيتريل لمدة 10 دقائق.
احتضان كل قطعة هلام مع 10 ملليمولار DTT و 25 ميليمولار بيكربونات الاميونيوم لمدة 45 دقيقة في 56 درجة مئوية. ثم، والتخلص من DTT واحتضان قطعة هلام مع 55 ملليمولار iodoacetamide في bicarbonate الأمونيوم 25 ملليمتر لمدة 35 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. لوقف الألكيليشن، والتخلص من الحل المستخدم واحتضان كل قطعة هلام مع 200 ميكرولتر من 10 ملليمتر DTT في 25 ميليمولاري الميكرومونيوم bicarbonate لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
غسل القطع هلام في 200 ميكرولترات من بيكربونات الميكرومونيوم 25 ملليمتر. ثم, الجفاف مع 200 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونتريل لمدة 10 دقائق. استوعب البروتينات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع تريبسين/ليس-سي ميكس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
استخراج الببتيدات الناتجة من قطع هلام بإضافة 50 ميكرولترات من 50٪ الأسيتونتريل لمدة 15 دقيقة في أنابيب منخفضة الامتصاص. بعد إضافة 50 ميكرولترات من حمض 5٪ من ففورميك لمدة 15 دقيقة، إضافة 50 ميكرولترات من 100٪ الأسيتونتريل لمدة 15 دقيقة. سحب وتجفيف كل جزء في أنابيب منخفضة الامتصاص للحد من امتصاص الببتيدات وفقدان العينة.
تخزين العينات في 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل كما هو مفصل في بروتوكول النص. يظهر هنا هو النقاء ممثل تقييمها من قبل تدفق الخلايا بعد اختيار الخرز المغناطيسي من أحادية CD14 إيجابية. تظهر صور الطور التباين للضامة البشرية المتباينة عدم تجانس المورفولوجيا التي تم الحصول عليها لاثنين من الاستقطابات المختلفة بعد تسعة أيام من الثقافة.
مثال على الهضم خارج هلام باستخدام الفضة ملطخة SDS صفحة المواد الهلامية. تقييم البروتين من تحلل الخلايا وبعد الهضم في حل يظهر عدم وجود تدهور أثناء التحلل وكفاءة الهضم. يظهر هنا مثال على طيف تفكك الناجم عن الاصطدام من الببتيد وجدت في نسبة الشامل إلى تهمة من 597.29 على الطيف MS مع شحنة كهربائية من اثنين إيجابي.
ومن هذا الطيف، تم تحديد التسلسل المقابل. والنتيجة النهائية بعد التحليل هي خريطة حرارية تمثل التجميع الهرمي لجميع حالات الاستقطاب باستخدام البروتينات المعبّر عنها بشكل تفاضلي. تحليل يكشف عن مجموعة من البروتينات الإفراط في التعبير عنها في جميع الاستقطابات في حالة الأكسجين 3٪.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن عليك أن تقرر أولاً أي نوع من الكسر سوف تؤدي على عينات جديدة لتكييف بروتوكول الخاص وفقا لذلك. إن النهج البروتومي الذي يستخدم هذا العمل مكمل للنهج الجينومية التي استخدمت خلال السنوات الأخيرة في مجال دراسات الاستقطاب البيولوجية الضامة. بعد تطورها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحث في مجال علم المناعة لاستكشاف الحالات المختلفة لتنشيط الخلايا المناعية في البشر وكذلك في الثدييات الأخرى.
لا ننسى أن العمل مع DTT يمكن أن تكون خطرة لذلك تحتاج إلى العمل تحت غطاء محرك السيارة تكييفها للقيام بهذا الإجراء.
