سيسمح هذا البروتوكول للباحثين بالإجابة على الأسئلة المهمة حول أنماط الخلايا العصبية للاتصال والتنظيم المكاني الذي يقوم عليه العمل داخل الدائرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن التصور من مورفولوجيا الخلايا العصبية الموجودة في عمق الأنسجة ثلاثية الأبعاد سليمة. هذه الطريقة واضحة وبالتالي يمكن استنساخها بسهولة.
يجب أن يكون المجربون لأول مرة مرتاحين لأداء هذه التقنية. من الضروري الحصول على عينة أنسجة واضحة من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة. وسوف العرض البصري للوضوح الأنسجة المناسبة وتقنيات المقاصة تمكين نتائج قابلة للاستنساخ بسهولة.
للبدء، ضع أنسجة الدماغ المغمورة بالهيدروجيل في حاضنة فراغ لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية مع فراغ ناقص 90 كيلوباسكال. اترك الأنبوب العلوي غير مفكك للسماح للفراغ بالتشكل بشكل صحيح. غسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
ضع عينة الأنسجة البلمرة في غرفة الكهرومورفوريس، مع تتبع اتجاه الأنسجة داخل الغرفة. ملء الغرفة والخزان مع العازلة SDS الكهربائي الموردة. تشغيل العينة في 70 فولت، أمبير واحد، و 35 درجة مئوية مع تيار ثابت لمدة ساعتين تقريبا لكل ملليلتر من الأنسجة.
تحقق من العينة بشكل دوري للتأكد من تطهير كافية من أنسجة الدماغ عن طريق إزالته من الغرفة واستبداله في نفس الاتجاه. بعد الانتهاء من مسح العينة، وغسلها في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، واستبدال برنامج تلفزيوني مع برنامج تلفزيوني جديد في كثير من الأحيان ممكن. بعد الغسل النهائي في PBS، اغسل الأنسجة لمدة خمس دقائق في الماء المتأين في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات.
سوف تصبح الأنسجة مبهمة وقد تتوسع. احتضان الأنسجة في محلول مطابقة مؤشر الانكسار لمدة أربع ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، وبناء غرفة سكنية مناسبة لتصوير العينة.
ابدأ باستخدام شريحة زجاجية كقاعدة للتركيب ، ثم ضع إما مسافات مطاطية أو بلاستيكية وآمنها بالغراء الفائق ، مع التأكد من عدم وجود أي ثقوب. ضع الأنسجة الواضحة في غرفة التركيب المليئة مسبقا بمحلول مطابقة الفهرس الانكساري. جبل آمن الأنسجة عن طريق وضع غطاء زجاجي على رأس وختم مع طلاء الأظافر.
صورة هذا النسيج عن طريق إضافة قطرة من مؤشر الانكسار مطابقة حل تصاعد مباشرة على رأس الزجاج. لبناء غرفة تصوير أنسجة كبيرة للأنسجة التي يزيد سمكها عن خمسة ملليمترات، استخدم طبق زجاجي طوله 10 سنتيمترات مع جدار مرتفع. ضع أنبوبا مخروطيا 50 ملليلتر في المركز ، مع التأكد من أن قطر الأنبوب كبير بما يكفي لقبول برميل العدسة الموضوعية المستخدمة.
جعل 3٪ agarose في الماء وتصب في الفضاء بين الطبق الزجاجي وأنبوب مخروطي، ثم السماح لها لتبرد لمدة ساعة واحدة. هذا سوف يشكل حلقة من الآغروز الصلبة. تلتزم بأمان الأنسجة إلى الجزء السفلي من الغرفة باستخدام الغراء السوبر وملء الغرفة مع معامل الانكسار مطابقة الحل، والتي قد تبدأ في البلمرة ما لم يتم الحفاظ عليها من الهواء وتخزينها في أربع درجات مئوية.
الحصول على الصورة باستخدام المجهر confocal. قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة. ضع العينة على المسرح.
اقترب بعناية من وسائل الإعلام الغمر مع الهدف وتشكيل عمود مستمر من وسائل الإعلام. باستخدام الفلورة، ابحث عن حقل تصوير مناسب. ابدأ بتعيين إعدادات الدقة وسرعة المسح الضوئي.
إذا التصوير باستخدام المجهر confocal، إغلاق الثقب تماما للحصول على أصغر قسم البصرية وبالتالي أفضل دقة Z. قم بزيادة قوة الليزر أو زيادة المستشعر تدريجيا حتى يتم الحصول على صورة مناسبة بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. إذا كنت تستخدم معيار EGFP أو tdTomato التصوير بلونين، تعيين إعدادات جمع الضوء.
تعيين المعلمات Z-المكدس على أساس نقاط البداية والنهاية الملاحظة من الأنسجة. تعيين حجم الخطوة استنادا إلى دقة Z المطلوبة. سوف أحجام خطوة أصغر تسفر عن دقة Z أكبر، ولكن قد يؤدي إلى تبييض العينة.
عندما تكون راضيا عن إعدادات الحصول على الصورة، احصل على الصورة. تأكد من أن الصورة تحتوي على نسبة إشارة عالية إلى ضوضاء وتظهر حدودا متميزة للهياكل. بعد الحصول على الصورة ، تم تحليل مورفولوجيا الخلية التمثيلية باستخدام إحصاءات مضمنة وتصنيف البرامج النصية داخل برنامج التحليل.
البيانات التي تم جمعها يعكس أن العصبية 2 لديها أكبر من الهيكل dendritic مع كثافة أعلى من العمود الفقري مقارنة مع العصبية 1. لإثبات هذه النتيجة، تم إجراء تحليل شول القياسية، مما يؤكد أن العصبية 2 هو أكثر تعقيدا dendritically من العصبية 1 كما يدل على ذلك زيادة عدد تقاطعات شول في 50 إلى 100 ميكرومتر من سوما. الخلايا العصبية 1 يحتوي على نسبة أكبر من العمود الفقري مع أشكال أكثر مثل filopodia وهو نوع فرعي العمود الفقري غير ناضجة.
العمود الفقري مع رؤساء محددة، ودعا العمود الفقري الفطر، من المرجح أن تحتوي على نقاط الاشتباك العصبي أكثر تطورا ونضجا. وهكذا، الخلايا العصبية 2 هو أكثر نضجا مع كثافة أعلى من العمود الفقري ناضجة. بعد التطهير ، يمكن تلوين قطع الأنسجة باستخدام الكيمياء المناعية التقليدية.
