يسمح هذا البروتوكول بالتحقيق في مورفولوجيا الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية ويمكن أن يعطي فكرة عن التغيرات المورفولوجية الخلوية ودون الخلوية التي تحدث في حالات المرض. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير الشفافية البصرية للشبكية ويسمح عالية الدقة, التصوير ثلاثي الأبعاد, الأسلاك الدائرة, وهياكل الخلوية الفرعية غرامة من الخلايا العصبية الشبكية في إعداد هرمون شبكية العين. احث عيون الماوس مع ملقط منحني ونقلها إلى طبق بيتري صغير مع برنامج تلفزيوني 0.1 M.
كزة حفرة صغيرة على طول تقاطع القرنية تصلب مع الإبرة تحت المجهر تشريح، ثم نقل العين إلى 4٪ فورمالديهايد السلطة لمدة ساعة واحدة. نقل العين مرة أخرى إلى طبق مع برنامج تلفزيوني. تحت مجهر تشريح، استخدم مقص التشريح لقطع كل الطريق حول تقاطع كورنيوسكليال.
إزالة القرنية والعدسة. ثم قطع عليه في قاعدة العصب البصري وتقشير بعناية تصلب قبالة مع ملقط لعزل شبكية العين. جعل أربعة تخفيضات صغيرة بالتساوي حول شبكية العين واستخدام فرشاة تلميح غرامة انخفض في برنامج تلفزيوني لوضعها الجانب GCL شقة أسفل في شكل يشبه البرسيم على قطع مربع صغير من ورقة تصفية النيتروسليلوز.
التقط زاوية ورق النيتروسليلوز مع ملقط وضعه في لوحة بئر 48 مع 4٪ فورمالديهايد الطاقة لمدة ساعة واحدة، ثم نقل ورقة التصفية والشبكية إلى بئر مع برنامج تلفزيوني وغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما. ذوبان A4P0 الحل على الجليد. ثم نقل شبكية العين إلى محلول A4P0 واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.
أضف الزيت النباتي إلى البئر لتغطية محلول A4P0 بالكامل. احتضان في حمام مائي في 40 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات مع عدم اهتزاز. ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل.
احتضان شبكية العين في كبريتات دودسيل الصوديوم 10٪ في 40 درجة مئوية لمدة يومين مع اهتزاز لطيف ثم نقل ورقة التصفية والشبكية إلى PBS مع تريتون X-100 وغسل خمس مرات لمدة 90 دقيقة لكل غسل. بعد الغسل النهائي، قم بتخزين الشبكية عند أربع درجات مئوية في PBS-T مع 0.01٪ من أزيد الصوديوم أو انتقل مباشرة إلى تلطيخ المناعة. إزالة شبكية العين من ورقة التصفية عن طريق تقشير بلطف تشغيله مع فرشاة تلميح غرامة في PBS-T.
المحتضنة في الأجسام المضادة الأولية المخفف في حل حجب لمدة يومين في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة، اغسل خمس مرات لمدة 90 دقيقة في PBS-T. احتضان شبكية العين مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة في حل حجب لمدة يومين في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
حماية العينات من الضوء طوال الفترة المتبقية من الإجراء. غسل شبكية العين خمس مرات لمدة 90 دقيقة في 0.02 متر الفوسفات العازلة. أخيرا احتضان شبكية العين في معامل الانكسار القائم على سوربيتول مطابقة الحل في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف.
مخطط زلة غطاء زجاجي مع علامة دائمة تلميح غرامة لوضع علامة على حدود مربعة على الجزء الخلفي من شريحة المجهر الزجاجي. الوجه الشريحة واستخدام حقنة لتتبع الحدود مع خط رفيع من الشحوم السيليكون على الجزء الأمامي من الشريحة. ترك فجوة صغيرة في زاوية واحدة للحل تصاعد الزائدة للهروب.
نقل شبكية العين إلى وسط المنطقة المحيطة ووضعها مع فرشاة طرف غرامة بحيث تقع شقة مع الجانب مستقبلات ضوئية ضد الشريحة الزجاجية. ماصة ما يقرب من 60 ميكرولتر من sRIMS بحيث يغطي شبكية العين بالارض ويمتد إلى زاوية واحدة من الضميمة. تأكد من أن الشبكية تبقى مسطحة وفي مكانها.
تطبيق زلة الغطاء، بدءا من الزاوية مع SRIMS وخفض ببطء حتى يمس الشحوم على جميع الجوانب. ضع كومة من ثلاث زلات غطاء على كل جانب من شبكية العين المركبة كمسافة. استخدام حافة طويلة من شريحة أخرى للضغط على أسفل زلة الغطاء بحيث جبل مسطحة وحتى.
تخزين الشرائح في أربع درجات مئوية حتى التصوير. ابدأ بوضع الشريحة على مرحلة المجهر وتحديد موقع العينة. للحصول على صور Z مكدسة من العينات، والتركيز أولا على إشارة في كل قناة على حدة وتعيين وقت التعرض أو سرعة المسح الضوئي للمجاهر الفلورية أو confocal على التوالي.
تعيين النطاق للكدسة Z إما عن طريق تعيين المستوى البؤري يدويا في أعلى وأسفل النطاق المطلوب أو عن طريق تعيين نقطة الوسط ثم تحديد نطاق حول نقطة الوسط. ضبط حجم الخطوة أو عدد الشرائح حسب الرغبة. التقاط الصورة وحفظ الملف الأصلي.
ثم تصديرها كملف TIF أو تنسيق آخر المطلوب. استخدام تحليل الصور، والبرمجيات المفضلة لضبط السطوع والتباين في كل قناة حتى يتم تحقيق الوضوح الأمثل في كل من الصور المفردة وتقديم ثلاثي الأبعاد من المكدس Z. عند معالجتها مع بروتوكول CLARITY المعدلة الشفافية البصرية الكاملة في جميع أنحاء سمك شبكية العين لوحظ بالمقارنة مع شبكية العين التحكم غير المجهزة.
Z مكدسة الصور لScinin المخاريط المسمى في ONL، TH المسمى DAC في INL، وRBPMS RGCs ملحوظ في GCL تظهر هنا. لوحظ الموقع النسبي للخلايا العصبية في جميع أنحاء سمك شبكية العين بأكمله في صورة التراكب. تمت مقارنة تلطيخ TH و CLARITY بشبكية العين الكاملة في جبل مع الصور التي تم الحصول عليها من التحضير القياسي.
تم الكشف عن Dendrites والعمليات الشبيهة بالمكون المحوري ل DACs بوضوح أكبر في شبكية العين المجهزة الوضوح مما كانت عليه في شبكية العين القياسية. أظهرت العمليات الشبيهة بالفأس من DACs هياكل كاملة تشبه الحلقة في شبكية العين الوضوح مقارنة بشبكية العين القياسية. كانت الهياكل الشبيهة بالحلقة لشبكية العين CLARITY التي تم التقاطها باستخدام المجهر الفلوري متطابقة تقريبا مع تلك التي لوحظت باستخدام المجهر الكونف البؤري.
كما ركضت العمليات الشبيهة بالمقرن نحو شبكية العين الخارجية. وأظهرت تلطيخ المناعة ضد GluA2 و PSD-95 puncta متميزة، والكشف عن GluA2 الفردية التي تحتوي على مستقبلات AMPA ومواقع ما بعد متشابك المفترضة، على التوالي. وأظهرت صورة تراكب بعض puncta على عمليات لجنة المساعدة الإنمائية.
وعرضت نقاط التوطين المشترك المفترض في طائرات XZ وYZ وXY وTH المترجمة بشكل مشترك مع كل من GluA2 و PSD-95. من المهم أن تبقى شبكية العين مسطحة أثناء عملية بلمرة الهيدروجيل بحيث يمكن للشبكية التي تم تطهيرها وضع مسطحة لعملية التركيب والتصوير.
