يتم استخدام ثقافة الأعضاء من نوع Trowell لزراعة الأنسجة الخارجية. نوضح هنا كيفية استخدام هذه الطريقة لدراسة الخلايا الجذعية في الأسنان التي تنمو باستمرار. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا دراسة الخلايا الجذعية وسلوكها في مكانه وفحص تأثير الجزيئات المختلفة على بقاء الخلايا الجذعية وصيانتها.
يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة الخلايا الجذعية للأعضاء الأخرى أيضا ، مثل الجلد أو الغدة الثديية. ابدأ بوضع شبكات معدنية 30 ملم مع ثقوب قطرها من ملليمتر إلى مليمترين في طبق بتري 35 ملم. املأ المكان بالوسائط حتى تصل الوسائط إلى سطح الشبكة.
بعد ذلك ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم عزل الأنسجة وجاهزة للزراعة. بعد قطع رأس الفأر ، قم بإزالة الجلد لفضح الفك السفلي وقطع عضلات الفك السفلي لفصل الفك السفلي عن الفك العلوي وبقية الرأس. بمجرد عزل الفك السفلي ، قم بإزالة اللسان والحد الأقصى من الأنسجة الرخوة.
تقسيم الفك السفلي في خط الوسط عن طريق قطع من خلال الارتفاق . ضع الفك السفلي في طبق بتري الذي يحتوي على PBS على الجليد. استخدم إبرة تحت الجلد يمكن التخلص منها بقياس 20 × 26 لتشريح القاطعة.
بعد ذلك ، قم بتنظيف الأنسجة الرخوة والأنسجة العضلية من سطح العظام للحصول على تصور أفضل. بالنسبة للفك السفلي الذي تم الحصول عليه من الحيوانات التي يقل عمرها عن 10 أيام ، استخدم إبر تحت الجلد يمكن التخلص منها 20 × 26 لفتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع. افصل القاطعة برفق عن العظم المحيط.
قطع الطرف القريب الذي يحتوي على حلقة عنق الرحم وإزالة المينا المعدنية ومصفوفة العاج. احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني Dulbecco على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 10 أيام ، افتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع.
استخدم الملقط للإمساك بالفك السفلي وكسر العظم لكشف السن. قطع النهاية القريبة التي تحتوي على حلقة عنق الرحم. احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني Dulbecco على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع.
ضع بعناية مرشحات المستطيل أعلى الشبكة في طبق ثقافة تم تسخينه مسبقا وقم بتوجيه قطع الأنسجة بشكل صحيح. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ورطوبة 90 إلى 95٪. قم بتغيير الوسيط بعناية في أيام بديلة ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء.
راقب نمو الأنسجة والتقط الصور يوميا. أخرج وسط الاستزراع من الطبق وأضف بعناية الميثانول المثلج إلى الأنسجة. ثم احتضنها لمدة خمس دقائق.
انقل مرشحا يحمل نبتة الأنسجة إلى أنبوب أخذ العينات المملوء بمحلول التثبيت. ثبت النبات في 4٪ بارافورمالدهيد المحضر في PBS بحد أقصى بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. تتواجد الخلايا الجذعية الظهارية في مكان يسمى حلقة عنق الرحم ، وتقع في الطرف القريب من القاطعة.
تتكون حلقة عنق الرحم من ظهارة مينا داخلية وخارجية تغلف الشبكة النجمية ، وهي نواة من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل فضفاض. تحتوي كل قاطعة على حلقة عنق الرحم الشفوية وحلقة عنق الرحم اللسانية ولكن حلقة عنق الرحم الشفوية فقط هي التي تحتوي على الخلايا الجذعية. تم التقاط الطرف القريب من القاطعة ، المعزولة من فئران Sox2-GFP بعد الولادة لمدة يومين ، مما مكن من تحديد وتصور الخلايا الجذعية الظهارية القاطعة المعبرة عن Sox2.
في حلقات عنق الرحم المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا Sox2-GFP و Fucci الحمراء ، تم تحديد الخلايا الجذعية الإيجابية GFP والخلايا غير التكاثرية الإيجابية Fucci-red. تم استخدام تعبير Sox2-GFP كمراسل لتحليل تأثير منشط إشارات Wnt / beta-catenin BIO ، والذي أثر سلبا على الخلايا الجذعية المعبرة عن Sox2 بالإضافة إلى تعبير GFP. يمكن تحسين هذه التقنية للتصوير المباشر لسلوك الخلايا الجذعية.
يمكن أيضا معالجة النباتات المضغوطة أو المستزرعة إنزيميا إلى معلقات أحادية الخلية لمزيد من التحليل.
