الكبد هو أكبر عضو في الثدييات. يلعب دورا هاما جدا في عملية التمثيل الغذائي وإزالة السموم. على الرغم من أن الكبد لديه قدرات تجديد ملحوظة في المختبر، فإنه لا يزال تحديا كبيرا جدا على المدى الطويل لثقافة الكبد في المختبر.
هنا، ونحن إنشاء الخلايا الكبدية organoids من خلايا الكبد ناضجة. فإنه يحتفظ السمات الرئيسية للخلايا الكبدية في مورفولوجيا ووظيفة. في هذا الفيديو، سوف نقدم كيفية زراعة وتمرير هذه organoids وكيفية إجراء التعديل الوراثي لهذه organoids في التفاصيل.
أولا، تغلغل الكبد والهضم. إعداد جميع المناطق والأدوات وجعلها عقيمة. غسل الماوس وفتح البشرة والجلد، ومن ثم محاولة العثور على فرن الحقيبة من الكبد.
حقن الإبر في ذلك، ومن ثم التقاط هذا. القيام التشوه بسرعة خمسة ملليلتر في الدقيقة الواحدة، حتى يصبح الكبد شاحب. تغييرها إلى المخزن المؤقت للتشويش، ضع بعناية، ومشاهدة الكبد، حتى يصبح لينة.
عادة ما يستغرق الأمر من ثلاث إلى خمس دقائق، ثم يقطع الكبد ويضعه في الصفائح، ويقطع إلى قطع صغيرة بالمقص. بيب صعودا وهبوطا في كثير من الأحيان. عادة، يستغرق 10 إلى 15 دقيقة لجعلها في خلية واحدة.
ومن ثم بيب صعودا وهبوطا مع 10 إلى 15 دقيقة وإطعامهم من خلال صالح. جعلها في خلايا واحدة. جمع جميع الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر، والطرد المركزي لهم، مع السرعة ومن ثم جمع كل لوحات.
حاول أن تبقيهم دائما في الجليد البارد جعل تعليق خلية واحدة والعد لهم مع عداد الخلية. عادة ما تكون خلايا الكبد إذا سعيدة، فقد الفلورسنت حية.
الجزء الثاني، ونحن نحاول الجلوس الخلايا والقيام ثقافة organoid. نجمع كل تعليق الخلايا ونحسب الخلايا مع إندماج محاري معين ومن ثم نخلط (ميتروجلز) و وسط التعليمات البرمجية.
عادة ما نأخذ، مع المتوسطة وmetrogels، في نسبة 1 إلى 2 أو 1 إلى 3. بعد خلط بعناية لهم، ونحن نجلس لهم على لوحات التدرج. عادة ما نضيف 100 ميكرولتر في 24 لوحة جيدا.
وضعها في الحاضنة في درجة حرارة 37 درجة. بعد 20 دقيقة، وضعناها عكس إلى الأمام مع أسفل في الجزء السفلي ومن ثم في الوسط. مع يومين أو ثلاثة أيام مضادة، ونحن عادة ما نرى organoids يخرج.
هذه هي الصورة النموذجية للأعضاء لدينا. نحن عادة بحاجة إلى خلايا واحدة من organoids إذا كنا نريد أن نفعل مرور أو القيام ببعض طريقة التعديل الجيني نجمع جميع organoids من لوحات مضادة مع العازلة غسل معطف. نسقط الناطقة، ثم في مخزن غسيل المعطف في الطبق، نخلطها، لذا نهزها صعودا وهبوطا.
ومن ثم نحن عادة ما قبل غسل جميع النصائح مع المخزن المؤقت للأشرطة غسل. لتجنب كل تلميح organoids على نصائح. وبعد ذلك مع، دفعة جديدة على الجليد أو بدونه، نجمع كل الأجهزة العضوية عن طريق الانصهار المركزي.
نعالجهم، هناك أشعة الخداع لإزالة جميع ال المتروجيل. بعد 20 إلى 30 دقيقة من الحضانة على الجليد تتم إزالة جميع المتروجيلات. نحن جمع جميع organoids نظيفة وإضافة تريبسين لجعلها في خلايا واحدة.
بعد إضافة التريبسين ، نعالج الأعضاء العضوية في الحاضنة. يستغرق 5 إلى 10 دقائق لالأعضاء الكبد لتصبح خلايا واحدة. نضيف المزيد من مخازن الغسيل لوقف تريبلاتين.
ومن ثم حماسه صعودا وهبوطا نحوهم. لعملية الخيار، يمكنك غسلها مرة أخرى لإزالة كل تريبسين. بعد غسلها عن طريق ال سنتروفوسيون، يمكننا عدها تحت عداد الخلية.
ثم سوف نظهر كيفية القيام بالمعاملات أو العدوى من هذه الخلايا الكبدية organoids. أولا، قم بتسمية أنابيب ما ستفعله، ثم سنقوم بتعصير البصر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحتاج، الوصي على حقيقة ليبويل ترويض INI MaX.
نضيف. السيطرة والجينات محددة siRNA، واحتضان لهم مع الأمثل، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ومن ثم وفقا لتركيز الخلية نضيف الحد الأقصى RAN ومزجها جيدا.
ثم نضيف أيضا الحد الأقصى RAN مع الأمثل بشكل منفصل ووضعها على الجليد. بعد 5 دقائق، ونحن بيب حتى منفصلة RAN ماكس خليط مع siRNAs مختلفة، جين محدد RANi والتحكم الثاني بشكل منفصل ومزجها بدقة. وضعها على الجليد مرة أخرى، ومن ثم نجمع كل organoids، والقنطور بطيئة، وإسقاط كل supernatant، نضيف ماكس RNAI، خليط سيرنا في هذه اللوحة الخلية وبيب عليه صعودا وهبوطا بدقة.
لفترة وجيزة، كانت الخلايا وتسمية RNAI ماكس وخليط سيرنا التحسين واحتضان لمدة 4 إلى 5 ساعات في 37 درجة. الجزء الأخير، هذه الخلايا الكبدية organoids يمكن أيضا أن تكون مصابة بفيروس لينتي. تم تنفيذ رسالة مماثلة كما نقل سيرنا.
تم إعداد أنابيب التحكم وفيروس siRNA بشكل جيد ، وتم إضافة الأمثل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم مع مناطق العدوى مثل بولي الأخضر ومن ثم نضيف فيروس لينتي مختلفة، وفقا لدستور تعليمات الشركة المصنعة. الجمع بين تعليق خلية واحدة في ثقافة organoids والجسيمات المختلفة في أنابيب eppendorf 1.5 ملليلتر، إضافة، حسنا، مزيج منهم لوحة هذا الخليط، وتركيزها لمدة 1 ساعة في 32 درجة.
سيتم إجراء الانصهار التركيز في 500 G.And بعد 4 إلى 5 ساعات حضانة في 37 درجة تعليق الخلية ثم سيتم جمعها والجلوس في المتروجيل. ووضعها في الحاضنة مرة أخرى. الجهاز على كفاءة تشكيل أو تحليل وظيفي آخر يمكن أن يؤديها 7 إلى 10 أيام في وقت لاحق.
وهنا نتائجنا التمثيلية. في الشكل 1A، هل يمكن أن نرى لدينا ALB-Cre Rosa 26-GFP أو الخلايا الكبدية RFP organoid من الماوس. في الشكل 1B يمكنك أن ترى إشارة إيجابية Ki67 في تلطيخ، والتي أظهرت أن لدينا organoids خلايا الكبد تتكاثر.
في الشكل 2A و 2B هنا هو تعبير جيني تمثيلي عن تعبيرنا التدخلي لجيناتنا. بعد التلاعب الجيني في الخلايا الكبدية organoids ، فإن التدخل الفعال فعال للغاية. هنا الشكل 2C، هل يمكن أن نرى بعد التلاعب الجيني مع التكنولوجيا كارسونيت في organoids مورين لدينا.
الاستنتاج، أظهرت نتائجنا أن الخلايا الكبدية العضوية يمكن توسيعها في المختبر والتلاعب بها وراثيا. باختصار، في هذا الفيديو نعرض كيفية القيام بتشوه الكبد والهضم للحصول على خلايا الكبد. كيفية التقاط خلايا الكبد والمرور organoids خلايا الكبد.
أيضا، أظهرنا كيفية القيام سيرنا وناقل العدوى أو عدوى فيروس ليندي للقيام بتعديل الوراثية من هذه organoids. أيضا، لدينا نقصان في الأعضاء لدينا. أولا، لم نستخدم كل نواة أو نواة فرو لتنقية خلايا الكبد.
وثانيا أعتقد أن المزيد من عوامل النمو والإشارات يجب أن تحاول تحسين الوقت المتزايد organoids.
