وستحافظ طريقة قطع شرائح الرئة الدقيقة على الهيكل والتوجهات المكانية في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي ويمكن أن تكون بمثابة نموذج بديل حي للسفن وقياسات انقباض مجرى الهواء. بالاقتران مع التصوير الفاصل الزمني ، واللطخة الغربية ، وتحليل الحمض النووي الريبي ، تساهم شرائح الرئة المقطوعة بدقة في الفهم الشامل لسلاسل الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات وتؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية. للبدء، ضع الماوس البالغ القتل الرحيم في وضع ية وآمنة في مكانها عن طريق تسجيل الكفوف والأنف إلى الطاولة مع شريط لاصق.
رش سطح البطن من الماوس مع 70٪ الإيثانول. استخدم ملقط لرفع جلد البطن من الماوس في موقع المثانة ومقص الجراحية لقطع في خط الوسط، والانتقال بشكل متفوق إلى منطقة عنق الرحم لفضح القصبة الهوائية. ثم استخدم الملاقط لرفع طبقة اللفافة الأساسية واستخدام مقص الجراحية لفضح الأعضاء الحشوية ومقصورة الوسطين، وقطع مرة أخرى أقل شأنا إلى متفوقة.
قطع القص في منتصف الخط لفضح القلب والرئة. تشريح الحجاب الحاجز بعناية من الكبد ومقصورة البطن. تحديد موقع كافا الوريد السفلي تحت الأمعاء وقطع عليه.
بعد تحديد موقع البطين الأيمن، استخدم إبرة فراشة قياس 25 إلى 30 لحقن 0.5 ملليلتر من الهيبارين 1٪ مجزأة في البطين الأيمن وتدفق ببطء ولكن بثبات مع 10 إلى 15 ملليمتر من برنامج تلفزيوني. بعد تحديد موقع الحنجرة، استخدم ملاقط طرف حادة لتشريح اللفافة المحيطة والأنسجة، ثم وضع خياطة الجراحية تحت القصبة الهوائية وربط فضفاضة عقدة الجراحية. وضع ثقب صغير في القصبة الهوائية متفوقة على السلسلة و cannulate مع إبرة قياس 20 حادة النهاية.
شد الغرز حول الإبرة والقرصة باستخدام عقدة جراحية. ثم حقن 2.5 إلى 4 ملليلتر من الآغاروز في القصبة الهوائية ورصد التضخم في الرئة. بعد حقن agarose، صب برنامج تلفزيوني الباردة على الرئة لترسيخ agarose.
ثم قطع القصبة الهوائية متفوقة على خياطة الجراحية وتشريح الرئة والقلب من mediastinum عن طريق إزالة أي التصاقات واللفافة. بعد التجسيد، ضع الأنسجة في DMEM في طبق بيتري على الجليد، والمضي قدما على الفور إلى تشريح فص واحد باستخدام آلة هزاز. لإعداد شرائح الرئة، قم بإرفاق العينة بالمنصة مع الغراء الفائق، مع الحفاظ على الجانب الوسيط الذي يواجه.
ثم ملء حاوية عينة مع برنامج تلفزيوني. ملء الحاوية مع الجليد للحفاظ على برنامج تلفزيوني المحيطة وعينة الباردة. تشغيل الهزاز.
ضبط سمك إلى 300 ميكرومتر، والتردد إلى 100 هيرتز، والسعة إلى 0.6 ملليمتر، والسرعة إلى خمسة ميكرومتر في الثانية الواحدة. باستخدام وجع ألين، قم بتحويل حامل النصل إلى الوضع الآمن وافتح الفكين لإدخال شفرة. ثم تشديد الفكين مع وجع ألن.
ضع العينة على الصندوق، وتأكد من غمرها في برنامج تلفزيوني. حرك المربع لأعلى في الموضع الصحيح وتأكد من أنه آمن. تحويل حامل النصل إلى الموضع المناسب للتقطيع.
جلب شفرة الهزاز تصل إلى حافة الكتلة وخفض يدويا شفرة حتى يكون حتى مع الجزء العلوي من العينة. تأكد من الإعدادات وتشغيل الهزاز. بعد قطع الشرائح الطازجة، قم بإزالة العينات من برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بيتري معقم مع 10 ملليلترات من DMEM تحتوي على مضاد حيوي مضاد للميكوزيلمرة واحدة.
بعد وضع جميع الشرائح في طبق بيتري، تراجع عن النصل تماما واستخدم مفتاح ألين لرفع النصل إلى وضع آمن. تخزين العينات في DMEM في 37 درجة مئوية. ووضع شريحة هزاز على شريحة المجهر.
استخدم مسح التنظيف لإزالة الوسط الزائد. ضع العينة على المجهري التباين المرحلة واستخدام 10 إلى 20X التكبير لتحديد السفينة. ثم أضف 500 ميكرولتر من أجهزة الأوعية الدموية، مثل كلوريد البوتاسيوم 60 ملليمولار أو واحد الاندوثين-1 ميكرومولار لغمر الشريحة تماما.
مراقبة والتقاط الفيديو عن طريق تسجيل لمدة 30 إلى 60 ثانية. قبل بدء التجربة، قم بملء صندوق رغوة البوليسترين الصغير بلتر واحد من النيتروجين السائل ووضع أنبوبين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر في الحاوية بالنيتروجين السائل. ضع أربع إلى خمس شرائح هزاز طازجة في وعاء هاون.
صب 5 إلى 10 ملليلتر من النيتروجين السائل على رأس شرائح واستخدام الحشرات بسرعة لطحن شرائح إلى مسحوق قبل أن يتبخر النيتروجين السائل. استخدام مغرفة مختبر الصلب المبردة مسبقا لغرف مسحوق في اثنين من أنابيب الطرد الدقيق المبردة وتحلل مسحوق بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي أو 500 ميكرولتر من العازلة RIPA لتحلل البروتين. في تجربة الجدوى التمثيلية ، تم الكشف عن تغيير لون شرائح PCLS من اليوم صفر إلى يوم واحد واليوم التاسع إلى العاشر.
كان الحل أزرق في البداية وتحول إلى اللون الوردي بين عشية وضحاها ، مما يدل على الجدوى. يحدث تغيير اللون عادة في غضون ساعة إلى أربع ساعات، ولكن قد يكون من الضروري وقتا أطول. يظهر الفرق اليومي بين الامتصاص عند أطوال موجية 562 و613 نانومتر للأنسجة المحضرة بالهزاز هنا.
يمكن تصور انقباض الأوعية الدموية في أنسجة الرئة المعدة للهزاز باستخدام الإندوتيلين-1 وكلوريد البوتاسيوم هنا. الحفاظ على وضع العلامات tdTomato في الخلايا بعد أسبوع واحد من حقن تاموكسيفين هو واضح في هذه الشرائح الرئة. من المهم للغاية إجراء تطهير الرئة والتضخم خطوة جيدة لإزالة جميع الدم من الدورة الدموية قبل إجراء تجارب إضافية والتصوير.
بالإضافة إلى أمراض الأوعية الدموية ، يمكن تطبيق PCLS لدراسة علم الأحياء الطبيعية للأمراض المرتبطة بالجوي ، ويمكن إجراء المزيد من الاختبار على أنسجة الرئة البشرية في السيناريوهات ذات الصلة سريريا.
