يقدم هذا البروتوكول طريقة جديدة لزراعة وصيانة ثقافات المجال البشرة ، واستراتيجية للتحقيق عن كثب باستخدام المقايسة إعادة تشريح كروية. ابدأ بإعداد وسيط غسيل كما هو موضح في المخطوطة النصية. في غطاء تدفق صفح، اغسل القلفة الوليدية مرتين بخمسة ملليلترات من وسائط الغسيل في أنبوب مخروطي ملليلتر خمسة، ثم نقل القلفة المغسولة إلى طبق بيتري معقم.
باستخدام مشرط والملقط، كشط قبالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة فضفاضة من الطبقة الجلدية، ثم إعادة غسل القلفة مع وسائل الإعلام غسل. ضع جانب البشرة القلفة في لوحة من ستة آبار تحتوي على ملليلترين من إنزيم Dispase المخفف في وسائط الغسيل. نقل اللوحة إلى حاضنة لمدة أربع ساعات.
بعد الحضانة، نقل القلفة إلى طبق بيتري واستخدام ملقط تلميح غرامة لفصل البشرة من طبقة الأدمة. ضع البشرة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على ملليلترين من 0.25٪ تريبسين-EDTA. سحق البشرة العائمة باستخدام ماصة مصلية خمسة ملليلتر واحتضانه لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع دوامة دورية لمدة خمس ثوان كل خمس دقائق.
بعد الحضانة، إضافة اثنين من ملليلتر من مثبطات تريبسين فول الصويا ومزجها عن طريق pipetting لتحييد تريبسين، ثم الطرد المركزي تعليق الخلية. Resuspend بيليه في 12 ملليلتر من المتوسط KSFM-SCM كاملة ولوحة الخلايا في طبق 10 سم لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، قم بإزالة الوسط باستخدام ماصة مقرصنة واستبدلها ب 12 ملليلتر من KSFM-SCM الكامل.
كرر هذا في اليومين الرابع والسابع. إعداد خليط 5٪ agarose بإضافة 2.5 غرام من الآغروز إلى 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في زجاجة 100 ملليلتر. أوتوكلاف الزجاجة على دورة السائل والسماح لها لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
لإعداد لوحات، ضع الزجاج المبرد الذي يحتوي على محلول الآجيروز في كوب لتر واحد مملوء ب 200 ملليلتر من الماء المؤين. تذوب خليط الآغاروز في ميكروويف من الدرجة البحثية لمدة تصل إلى دقيقتين، وخلط الآغاروز كل 60 ثانية عن طريق إمالة الزجاجة بلطف جنبا إلى جنب. إضافة ثلاثة ملليلتر من ذاب 5٪ agarose إلى 12 ملليلتر من KSFM-SCM قبل الحرب في 42 درجة مئوية لتركيز النهائي من 1٪ agarose.
إضافة 200 ميكرولتر من مزيج 1٪agar إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. ثم اترك الطبق في بيئة معقمة عند 25 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. مرور كروية تشكيل الخلايا القرنية البشرية العادية عن طريق التشويش وسائل الإعلام وغسل الخلايا في اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
أسبيرات برنامج تلفزيوني وإضافة اثنين من ملليلتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى الخلايا المغسولة. ثم تحتضن لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، إضافة اثنين من ملليلتر من مثبطات فول الصويا تريبسين إلى لوحة وغسل الخلايا من لوحة في أنبوب 15 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي في 250 مرة G لمدة خمس دقائق. Resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وقياس الخلايا باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ. Aliquot 20, 000 الخلايا القرنية البشرية العادية في 100 ميكرولتر من KSFM-SCM والبذور الخلايا في كل بئر من لوحة 96 جيدا أعدت سابقا.
ثم احتضان لوحة بين عشية وضحاها. باستخدام المجهر النقيض من المرحلة المقلوبة، وتحليل الآبار المصنفة لتشكيل الكرة البشرة. بعد 24 إلى 48 ساعة من تشكيل كرة البشرة ثلاثية الأبعاد ، أضف أربعة ملليلترات من KSFM-SCM قبل الحرب عند 37 درجة مئوية إلى طبق طوله ستة سنتيمترات.
باستخدام تحمل واسعة واحدة تلميح ماصة ملليلتر، نقل كروية واحدة إلى لوحة واحتضان لوحة بين عشية وضحاها. تحليل كروية المصنف لربط أو نشر الخلايا باستخدام المجهر النقيض المرحلة مقلوب. تغذية الخلايا كل 96 ساعة عن طريق إزالة وسائل الإعلام وإضافة اثنين من ملليلتر من وسائل الإعلام KSFM-SCM الطازجة إلى لوحة.
مرور 70 إلى 80٪ التقاء الكريات الكيراتينية البشرية العادية المشتقة من كروية وثقافات أحادية الطبقة 2D كما هو موضح سابقا. ثم قياس صلاحية الخلية باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلية الآلي. Aliquot 100 ميكرولتر تحتوي على 100،000 إلى 4 ملايين الكيراتينية البشرية العادية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر.
ضع الأنابيب على الجليد في بيئة مظلمة عن طريق إطفاء الأضواء الساطعة داخل غطاء الغطاء. إضافة اثنين من microliters من FITC-اقتران المضادة integrin ألفا ستة واثنين من microliters من PE-اقترانها المضادة EGFR إلى أنابيب لتحقيق تخفيف واحد إلى 50. إعداد أنبوب مع عدم وجود أجسام مضادة المضافة لتكون بمثابة السيطرة غير ملطخة.
احتضان الأنابيب على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام الليزر المناسب. استخدام الضوابط السلبية والإيجابية لإنشاء البوابات.
فرز السكان الفرعية من كسر الخلايا الجذعية البشرة، وكسر الخلية السلف التكاثري، وارتكبت كسر الخلية السلف. اختبار لقدرة الانتشار من الخلايا الفرعية فرزها عن طريق نقل محتوى كل أنبوب الفرز كل منها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على 10 أضعاف حجم الخلايا المفرزة في برنامج تلفزيوني. طرد الأنابيب في 250 مرة G لمدة خمس دقائق.
إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في أربعة ملليلتر من KSFM-SCM. نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى لوحة ستة سنتيمترات واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ مع رطوبة 95٪. في اليوم التالي، قم بإزالة الوسائط من الصفائح وأضف أربعة ملليلترات من KSFM-SCM قبل الحرب عند 37 درجة مئوية كل ثلاثة أيام حتى يتم الوصول إلى التقاء 70 إلى 80٪.
تم تقييم قدرة تشكيل البشرة المستقلة للخلايا القرنية البشرية العادية في الثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام فحص مجال البشرة. لم يعتبر تجميع الخلايا غير الكروية تكوينا كافيا لكرة البشرة. واعتبر التجميع الكثيف على شكل كرة سمة مميزة لتشكيل كروي عفوي.
وكان من الضروري استخدام أكثر من مرتين 10 إلى الخلايا الأربع لضمان التجميع التلقائي السليم. أدى زرع مجالات البشرة في الثقافة 2D في انتشار الخلايا القرنية البشرية العادية الصغيرة الحجم قابلة للحياة. من المهم الحفاظ على هذه الثقافات تحت التقاء 100٪ لأن هذا يمكن أن يضعف بشكل كبير نموها وحالة الخلايا الجذعية في الثقافة.
تم تتبع عملية تشكيل كروية البشرة وظيفيا على مستوى الخلية الواحدة من قبل الخلايا المصابة مع مراسل الفلورسنت. Spheroid المستمدة من الخلايا القرنية البشرية العادية هي integrin ألفا ستة عالية وEGF هي خلايا منخفضة. تشكل الخلايا بشكل عام حوالي 25٪ من الثقافات.
تم تحقيق توصيف هذا الاكتظاظ السكاني الكيراتينية الشبيه بالقذعية عن طريق تحليل الالتقاط المناعي للسيتوكيراتين القاعدي 14 وبروتين الورم 63. إن الفحص اللاتشريعي للكفرويد هو استراتيجية فعالة لإثراء الخلايا الجذعية البشرة من جلد الإنسان الوليدي. يمكن استخدام هذا النظام كنموذج عالي الإنتاجية قائم على الخلايا للتحقيق في الأمراض الجلدية مثل التئام الجروح والسرطان.
