يوفر بروتوكولنا طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ وموثوقة لتوليد أحاديات الظهارية الأولية الأولية المباشرة على أسطح مختلفة مع الحد الأدنى من الحطام. المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هي انخفاض استهلاك وسائل الإعلام وانخفاض تكلفة الحفاظ على ثقافة الخلية. انها طريقة سريعة لإجراء الاختبارات الوظيفية والتطبيقات المصب السريع.
سيوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في دراسة إصلاح الجروح، وحاجز نفاذية، والهجرة عبر الظهارة من أنواع مختلفة من الخلايا. أيضا، يمكن أن يكون هذا النموذج مفيدا في التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض، والظهارية التالفة، واكتشاف المخدرات. للبدء، إضافة 200 ميكرولتر من حل الطلاء إلى كل بئر من لوحة 48 جيدا والشريحة الغرفة.
قبل حضانة كل من في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. معطف 0.4 ميكرومتر إدراج غشاء الخلية مع 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين. احتضان لوحة مع إدراج الغشاء في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم نقله إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
تطهير الماوس القتل الرحيم مع 70٪ الإيثانول، ثم تشريح القولون من المستقيم إلى تشيتشوم بمساعدة مقص والملقط. طرد بلطف من البراز مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة في حقنة 10 ملليلتر مزودة أنبوب تغذية قياس 20. إزالة القولون القريبة والشريحة القولون البعيدة بلطف على أنبوب التغذية قياس 20.
ربط القولون في نهاية الأنبوب مع خيط خياطة الحرير 4-0. عكس القولون من الداخل إلى الخارج على نهاية تعادل وربط الطرف الآخر مع الموضوع، ثم قطع القولون تحت غيض من أنبوب التغذية باستخدام مقص الجراحية. افتح بلطف الطرف غير المربوط من القولون المقلوب على طرف حقنة تكرار 1.25 ملليلتر باستخدام المكبس.
الشريحة نهاية غير مربوطة من القولون مقلوب على حقنة وربطه بإحكام مع الموضوع. أدخل المكبس في الحقنة ونفخ القولون حتى يبدو عكر مع عدم وجود تجاعيد مرئية. ضع نقانق القولون المتضخمة في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من محلول استعادة الخلايا على الجليد لمدة 20 دقيقة.
تضخيم وتفريغ القولون مرة واحدة كل خمس دقائق. ربط قبالة القولون المتضخم تحت غيض من حقنة تكرار باستخدام 4-0 خيوط الحرير. قطع نقانق القولون من الحقنة المتكررة ووضعها في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من 50 ملليمولار EDTA لمدة 40 دقيقة.
تدوير الأنبوب في أربع درجات مئوية. استبدل حل EDTA بخمسة ملليلترات من المخزن المؤقت للاهتزاز وهز النقانق يدويا في الوضع الرأسي لمدة دقيقتين. قم بفك محلول الاهتزاز في أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر وكرر خطوة الاهتزاز حتى يتم جمع ما مجموعه 10 ملليلترات من السرداب وحاجز الاهتزاز.
عد عدد سرداب في 20 ميكرولتر من التعليق تحت المجهر وتمييع العينة للحصول على تركيز خمسة سرداب لكل ميكرولتر. الطرد المركزي عينة سرداب في 400 مرة G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. في غضون ذلك، قم بإزالة لوحة 48 بئرا وإدراج الغشاء من الحاضنة ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية.
يستنشق محلول الطلاء باستخدام ماصة P200 واترك اللوحة مع الغطاءإزاحة قليلا حتى تصبح الخلايا جاهزة للطلاء. بعد الطرد المركزي من تعليق سرداب، وإزالة العازلة تهتز وإعادة إنفاق بيليه سليمة في ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام LWRN كاملة. إضافة 200 ميكرولتر من سرداب إلى كل بئر من لوحة المغلفة مسبقا 48 جيدا والشريحة غرفة واحتضان على حد سواء في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، يستنشق وسائل الإعلام وإضافة وسائل الإعلام الجديدة. عموما، تصبح الخلايا التقاء في 24 إلى 48 ساعة. لإدراج غشاء زراعة الخلية، أضف 200 ميكرولتر من سرداب إلى أعلى الإدراجات و600 ميكرولتر من وسائط LWRN الكاملة إلى الأسفل.
في اليوم التالي، يستنشق وسائل الإعلام وإضافة وسائل الإعلام الجديدة فقط إلى الغرفة العليا. احتضان لوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ في 37 درجة مئوية. قياس المقاومة الكهربائية عبر الإبط كل يوم باستخدام فولت الظهارية / أوم متر.
بعد عزل سرداب من القولون مورين والتحقق من التركيز، وتركز تعليق سرداب إلى خمسة سرداب لكل ميكرولتر. وتعرضت آبار صفائح من 48 بئرا لاحبار جرح الصفر عند الوصول إلى التقاء الخلية. وبعد 24 ساعة، لوحظ إصلاح الجروح مما يدل على أن الثقافة صحية وقابلة للحياة.
تم تحقيق قيم المستوى الأعلى عندما تم تغيير الوسائط من LWRN إلى وسائط التمايز. ولوحظ أيضا انخفاض في علامات مركز خدمة الدولة الإسلامية وزيادة في علامات التمايز مما يشير إلى أن الطبقات الأحادية المتمايزة قد ولدت بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر ظهور أنواع فرعية من الخلايا الظهارية المتمايزة التي تزرع في ظروف مختلفة عن طريق الفلورة المناعية.
عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم التأكد من أن القولون لا تمزق في أي نقطة أثناء الإعدادية ويبقى تضخم لإطلاق سرداب في إعداد نظيفة للغاية. مرة واحدة في شكل أحادي الخلية الظهارية المعوية 2D، يمكننا إجراء immunofluorescence، الجرح الصفر ويقازح نفاذية وغيرها من التطبيقات المصب. وهذا سيوفر المعرفة في التئام الجروح، والهجرة من أنواع مختلفة من الخلايا، وإصلاح الظهارية ودراسات الضرر.
