يتم دعم العمل في مختبر Januschke من قبل ويلكوم الاستئماني منح 100031/Z/12/A و 1000032/Z/12/A. ويدعم مرفق تصوير الأنسجة من قبل منحة WT101468 من ويلكوم.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

يوفر التصوير الحي لأدمغة يرقات جبل D. melanogaster الكامل الفرصة لمراقبة انقسامات الخلايا الجذعية العصبية غير المتماثلة في ظروف قريبة من السياق الفسيولوجي. يقدم الجزء الأول من بروتوكولنا نهجنا بشأن تشريح أدمغة اليرقات. كما ذكر بالفعل13, جانب حاسم من التحضير هو تجنب الإضرار الدماغ. الجانب الأكثر تحديا من هذا هو فصل الدماغ من الأقراص التصويرية المجاورة دون سحب مفرط على الدماغ. نهجنا ل "قطع دون سحب" هو أداء إما حركة طحن مع نصائح من زوج واحد من ملقط، أو الشريحة نصائح ملقط على طول اثنين من النصائح ملقط أخرى عقد العلاقة بين الأنسجة(الشكل 1A)في حين أن ليريت وآخرون وصف حركات تشبه المنشار مع دبوس تشريح. ننصح المجرب بتجربة جميع النهج واعتماد النهج الأنسب لأنفسهم. نقترح أيضا استخدام نصائح ماصة مغلفة ب BSA أو FCS بدلا من أدوات التشريح لنقل الأدمغة المعزولة. يمنع الطلاء الأنسجة من الالتصاق بالبلاستيك ويسمح بالانتقال الآمن للأنسجة مع إبقائها دائما مغمورة تماما ، دون تعريضها لتشوه عابر محتمل لأنها تلتزم أداة التشريح أثناء النقل. نصائح مغلفة لها مزايا أخرى للسماح بنقل العديد من العقول في وقت واحد، وهو أمر مفيد بشكل خاص عندما يكون من الأهمية بمكان للسيطرة على وقت الإقامة من العينات داخل وسيلة معينة؛ فهي مناسبة لنقل الأنسجة الأخرى، حتى تلك الهشة مثل، على سبيل المثال، الأجسام الدهنية. أنها يمكن أن تستوعب مجموعة واسعة من أحجام عينة مختلفة باستخدام نصائح أكبر أو قطع أقصى الطرف.
بعد ذلك ، يصف هذا البروتوكول استخدام تخثر الفيبرينوجين لشل حركة أدمغة اليرقات على غطاء طبق الثقافة. يتم توجيه الدماغ داخل قطرة من الثقافة المتوسطة + فيبرينوجين، وبعد ذلك يتم تحفيز التخثر عن طريق إضافة Thrombin. تشكيل الفيبرين تدريجيا ، مما يوفر نافذة زمنية يمكن خلالها ضبط اتجاه العينة ، إذا لزم الأمر(الشكل 2C). إذا كان هناك حاجة إلى ضغط طفيف للعينة - وهو ما ننصح بعدمه في حالة أدمغة اليرقات - يمكن أيضا تعديله بدقة عن طريق الضغط على الجلطة بشكل أو بآخر بالقرب من العينة خلال الخطوتين 3.4.4 و 3.5.2. الميزة الرئيسية لهذا تخثر الفيبرينوجين على البروتوكول الموصوف في Lerit وآخرون ، والتي يتم فيها تركيب الأدمغة بين غشاء نفاذية للغاز وأغطية ، هي القدرة على استبدال وسيط الثقافة أثناء التصوير الحي. يمكن أن تكون الميزة المحتملة لاستخدام غشاء نفاذية الغاز على بروتوكولنا أنه يوفر الأكسجين الأمثل للعينات، والتي يمكن أن تكون أكثر محدودية مع نهجنا كما يتم فصل العقول من الهواء عن طريق الجلطة وبعض المتوسطة. لهذا السبب ، على الرغم من أننا لم نقيم تأثير كمية الثقافة المتوسطة داخل طبق الثقافة ، نقترح الحد من كمية الثقافة المتوسطة فوق الجلطات مع الحفاظ على الجلطات مغمورة تماما.
وبما أن التلاعب بالجلطات يمكن أن يكون صعبا من الناحية التجريبية ويستغرق وقتا طويلا، فإننا نوصي بأن يمارس المجرب أولا التلاعب بالجلطات دون عينات. تعديل حجم انخفاض متوسطة الثقافة + فيبرينوجين على غطاء، وتركيز الفيبرينوجين أو حجم وتركيز Thrombin يمكن أن تساعد في جعل إعداد أسهل ويمكن أن تكون مهمة عند تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من الأنسجة. مع ما يكفي من الخبرة في التلاعب بالجلطات ، يمكن شل حركة العديد من الأدمغة في جلطة واحدة إذا لزم الأمر ، على الرغم من أنها تعقد الضبط الدقيق للتوجه. يمكن تشكيل العديد من الجلطات على غطاء الغطاء ، مما يسمح ، على سبيل المثال ، بتصوير عينات من أنماط جينية مختلفة. ومن الممكن أيضا لفضح جلطات مختلفة على نفس coverslip إلى وسائل الإعلام الثقافية المختلفة، على الرغم من أن الرعاية يجب أن تؤخذ أبدا لخلط قطرات من الثقافة المتوسطة التي تغطي جلطات مختلفة. بمجرد أن يتم شل حركة أدمغة اليرقات وجاهزة للتصوير الحي ، ننصح باتباع توصيات Lerit et al.13 لتجنب الفوتوداماج المفرط. نضيف فقط إلى هذه التوصيات ليس فقط للحفاظ على العقول في 25 درجة مئوية أثناء التصوير الحي مع حاضنة المرحلة، ولكن أيضا لتسخين هذه المرحلة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التصوير. وفي أيدينا، يؤدي الفشل في القيام بذلك بشكل منهجي إلى انجراف تركيز قوي.
يمكن أن يكون من المفيد في بعض السياقات أن تكون قادرة على إجراء المجهر المترابطة وإصلاح والمناعةالحصول على عينة بعد التصوير الحي. ومع ذلك ، فإن الحد من استخدام جلطات فيبرين هو أنه يكاد يكون من المستحيل عزل الدماغ ميكانيكيا من جلطة دون الإضرار بها. وهناك طريقة ممكنة للتغلب على هذا القيد يمكن أن يكون لتطوير أساليب لتحلل جلطات فيبرين مع بلازمين أو للحث على تفكيك جلطة بإضافة الببتيد تحاكي المقابض السماح فيبرين البلمرة28. نحن عادة ما نستخدم جلطات الفيبرين على عينات تتراوح بين خلايا واحدة إلى أنسجة طويلة 200 ميكرومتر ، ولكن يمكننا أيضا شل حركة الجلطات وأدمغة الصور من النحل البالغ الذي يزيد عرضه عن 3 مم. الحد الأعلى لحجم العينة التي يمكن شل حركتها في الجلطات لا يزال يتعين تحديده. وبالمثل ، على الرغم من أننا عادة ما نقوم بتصوير العينات المشلومة لمدة 4 إلى 5 ساعة ، إلا أننا نجحنا في تصوير الخلايا العصبية في الثقافة الأولية لمدة تصل إلى 3 أيام ، مما يشير إلى أن الجلطة على الأقل لا تتداخل مع الجدوى على المدى الطويل. على العكس من ذلك ، يمكن أن تسهل الجلطات الاستبدال المنتظم للوسط ، وهو شرط للتصوير على المدى الطويل ، دون الحاجة إلى أجهزة مثل المضخات العصاهر لهذا الغرض. في حين أننا لم نقيس المعلمات نفاذية جلطات الفيبرين ، فإن الطبيعة الليفية الشبيهة بالجل للجلطات تبدو قابلة للانشجار بواسطة جزيئات نفاذية الخلية. وجدنا أن لاتورونكولين A، Colcemid أو 1-NAPP1، هالو تاغ ليغاندس وغيرها من الأصباغ القياسية المستخدمة في بيولوجيا الخلية تصل إلى الخلايا في جلطة الفيبرين دون أي مشاكل وحتى الآن لم تواجه الجزيئات التي سيتم الاحتفاظ بها من قبل الجلطة، والتي، ومع ذلك، هو احتمال يحتاج إلى اختبار تجريبي.
في الختام ، باستخدام جلطات فيبرين توفير موثوق بها وسهلة نسبيا لتنفيذ وسيلة لشل الأنسجة الحية للتصوير الحي. وراء فائدتها في الحد من الانجراف الجانبي ، أثبتت القدرة على تغيير وسيط الثقافة أثناء التصوير الحي أنها لا تقدر بثمن لنهجنا في علم الوراثة الكيميائية لدراسة انقسام الخلايا غير المتماثلة في الخلايا العصبية D. melanogaster 21. نتوقع أن تكون هذه التقنية مفيدة للدراسات في مجموعة واسعة من الأنسجة المختلفة ، خاصة إذا كانت تنطوي على علم الوراثة الكيميائية أو ، على سبيل المثال ، وضع العلامات الذاتية للبروتين29.
يعتمد ماكرو MultiHyperStackReg لدينا على المكون الإضافي TurboReg ImageJ ، والذي يحاذي الإطارات المتتالية أو شرائح المكدس ، والمكون الإضافي MultiStackReg ImageJ ، والذي يسمح بتطبيق التحولات على أكوام أخرى. MultiHyperStackReg ببساطة يسمح لتطبيق هذه التحولات على hyperstacks (مكدسات مع أربعة أبعاد على الأقل). كما استخدام MultiHyperStackReg، كما وصفها، يتطلب الكثير من الإجراءات ويمكن الحصول على مضيعة للوقت تماما، كتبنا أيضا الماكرو AutoHyperStackReg، الذي ينفذ تلقائيا جميع الخطوات المذكورة في الخطوتين 6.2 و 6.3. ومع ذلك ، خلافا لMultiHyperStackReg ، AutoHyperStackReg تفتقر حاليا إلى إمكانية لحساب محاذاة كومة على أساس منطقة دون إقليمية من هذا المكدس ، وهو الخيار الذي وجدناه هو في بعض الأحيان حاسمة لمحاذاة مرضية. وهناك قيد آخر من AutoHyperStackReg هو أن يقتصر استخدامه على الترجمات وليس التحولات الأخرى المقترحة من قبل TurboReg وMultiStackReg، في حين MultiHyperStackReg يمكن أن تنطبق على hyperstack أي نوع التحول إذا كان المستخدم في حاجة إليها. ستنفذ الإصدارات المستقبلية هذه الوظائف وستكون متاحة على GitHub30. وأخيرا، يوفر الماكرو الدوار لدينا طريقة سهلة لقياس الإشارات القشرية بسرعة في الهفوات الزمنية، حتى لو غيرت القشرة موضعها أو اتجاهها بمرور الوقت. ما إذا كان وضع التتبع أو وضع عدم التتبع هو الأنسب للتحليل يعتمد على جودة واتساق الإشارة القشرية. وضع التتبع أسهل في الاستخدام حيث لا يحتاج المستخدم إلى النظر في مكان القشرة لكل نقطة زمنية ويمكن أن يستوعب تغييرات كبيرة في الموضع والتوجه بمرور الوقت. ومع ذلك ، فهي مناسبة فقط إذا كانت الإشارة القشرية لا تزال قوية بما يكفي للكشف خلال الفيلم بأكمله: الفشل في الكشف عن أي شيء آخر غير القشرة (على سبيل المثال ، مقصورة السيتوبلازمية الساطعة القريبة من القشرة) يمكن أن يعرض الكشف عن كل نقطة زمنية تالية للخطر (على سبيل المثال ، تتحرك المقصورة السيتوبلازمية بعيدا عن القشرة ويتبعها الخطوط القشرية لبقية الفاصل الزمني). لا يوجد في وضع عدم التتبع هذا المأزق حيث يقتصر الكشف على الخط الذي رسمه المستخدم في الأصل (على سبيل المثال ، قد تتسبب مقصورة السيتوبلازمية الساطعة في فشل الكشف لبضع نقاط زمنية ، ولكن مع تحرك المقصورة السيتوبلازمية بعيدا عن منطقة الكشف ، يستأنف الكشف المناسب عن القشرة) ، ولكنه لا يتصرف بشكل جيد إذا تغير موضع القشرة أو اتجاهها كثيرا بمرور الوقت. الميزة التالية (التي ستكون متاحة على GitHub30)التي سيتم تطويرها لوضع التتبع ستكون خيار تحليل النقاط الزمنية المحددة فقط وتحديد نقطة زمنية مرجعية (بدلا من النقطة الزمنية الأولى) قبل وبعد ذلك سيتم إجراء الكشف ، مما سيسمح للمستخدم بتجنب النقاط الزمنية الإشكالية على الأقل.

لا يزال دروسوفيلا نظاما نموذجيا مهما لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية وقد برع في تطوير المعرفة في العديد من التخصصات لعقود. ميزة واحدة تجعلها تبرز بشكل خاص هي أنها مناسبة بشكل خاص للتصوير الحي. القدرة على رصد العمليات دون الخلوية أو سلوك الخلايا والأنسجة في الوقت الحقيقي لا تزال تسهم في توليد المفاهيم الرئيسية ذات الصلة بيولوجيا الخلية والتنموية. وقد وضعت العديد من البروتوكولات الناجحة من قبل مجموعات مختلفة للحفاظ على هذه العينات Drosophila على قيد الحياة وصحية لدراسة سلوك العينة وجزيئات الفلورسنت الحية. يمكن استخراج الأعضاء والأنسجة من الذبابة مثل أقراص التصوير1،2، الدماغ اليرقات3،4،5،6، أو غرف البيض من الإناث البالغات7،8،9، أو الأمعاء البالغة10 على سبيل المثال وأبقى في الثقافة للتصوير بالمنظار الدقيق الفاصل زمنيا. يتمثل أحد التحديات الرئيسية للتصوير الحي في ضمان إبقاء العينة قريبة من سطح التصوير للحصول على الدقة المثلى وغير متحركة دون المساس بسلامة العينة التي يمكن أن تكون حساسة للتأثيرات الميكانيكية. لدراسة الخلايا الجذعية العصبية ، وتسمى الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية في الدماغ اليرقات Drosophila ، على سبيل المثال ، يمكن تحقيق إبقاء عينات قريبة من سطح التصوير من خلال تغطيتها مع وسائل الإعلام الثقافية في غرف التصوير مختومة11،12،13. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح بسهولة تبادل وسائل الإعلام مما يحد من المجال التجريبي للمناورة. بدلا من ذلك، يمكن إعداد العينات ووضعها على coverlips تعامل لزيادة التصاق الخلايا والسماح متعددة النقاط زيارة المجهر والتصوير الموسع للخلايا الحية في أطباق الثقافة المفتوحة، التي يحتمل أن تسمح تبادل وسائل الإعلام، ولكن لا توفر وسيلة سهلة لمنع الانجراف عينة أو فقدان خلال تبادل وسائل الإعلام14،15.
طريقة جلطة فيبرين وضعت أصلا لدراسة الخلايا المنوية الحية رافعة ذبابة16 مناسبة خصيصا للتغلب على هذه المشاكل. يذوب الفيبرينوجين في وسط الثقافة ذات الصلة ، ويتم وضع العينات وتوجيهها في قطرة من هذا المحلول على غرفة تصوير كافية على السطح الزجاجي قبل إضافة Thrombin ، مما يؤدي إلى تكوين سريع لجلطة فيبرين غير قابلة للذوبان ، وهي شبكة ليفية لزجة تلتزم بالسطح الزجاجي والعينات مع ضمان وصول العينة إلى وسيط الثقافة. ويمكن بعد ذلك تبادل الوسط دون اضطراب وضع الجلطة أو العينة. تبادل الثقافة المتوسطة أثناء التصوير هو، على سبيل المثال، مرغوب فيه عندما يتم إضافة مثبطات كما هو الحال في الطريقة الأصلية أو لغسل أو نبض مطاردة التجارب أو عندما الأصباغ الفلورية هي أن تضاف أثناء تصوير الخلايا الحية مع الحفاظ على الخلايا والأنسجة في مكانها. جلطات الفيبرين مناسبة لتصوير أنسجة الدروزوفيلا وكذلك الخلايا الفردية13،17. يمكن استخدام جلطات الفيبرين كذلك للمساعدة في توجيه العينات ، وذلك بسبب شكلها أو خصائص أخرى عادة لا تكون موجهة بالطريقة المطلوبة عن طريق تعديل موضع العينة داخل جلطة فيبرين وشكل الجلطة نفسها.
هنا نقدم تحديثا على أساليب التصوير الحالية القائمة على تجلط فيبرين وتوفير أدوات لتحليل الصور القائمة على التقسيم والتركيز على استخدام هذه الطريقة لدراسة الانقسامات الأرومية العصبية في الدماغ ذبابة النامية. نحن نستخدم بشكل روتيني طريقة جلطة فيبرين لمتابعة عينات متعددة في جلطات مختلفة في نفس طبق الثقافة. وهذا يسمح 1) تصوير الأحداث دون الخلوية مثل السلوك المركزي أو توطين ميرنا يعيش18،19، 2) رصد سلوك العينات على العلاج الدوائي من الأنماط الجينية المختلفة تحت نفس إعدادات التصوير باستخدام زيارة متعددة النقاط المجهر20، 3) دراسة آثار تثبيط حاد من الانزيمات21 و iv) التقليل من الانجراف لدراسة التغيرات في اتجاه انقسام الخلايا داخل بيئتها الفسيولوجية على المستهدفة الليزر الاستئصال22. في حين أن الآثار غير المرغوب فيها من ثروبين وفيبرينوجين وتجلط فيبرين تحتاج إلى اختبار تجريبي لكل عينة، هذه الطريقة هي من حيث المبدأ مناسبة لشل أي نوع من العينة التي سيتم تحليلها عن طريق التصوير بالخلايا الحية وفي Drosophila وقد استخدمت بنجاحلدراسةجوانب متعددة من بيولوجيا الخلايا العصبية 5،19،20، ولكن أيضا ديناميات توقعات cytosensor من الخلايا الجذعية خط الجرثومية الإناث23 والتغيرات في القطبية على تثبيط APKC الحاد للخلايا بصيلات الخلايا الإناث Drosophila 21.
يؤدي التصوير الفلوري الفاصل زمنيا إلى إنشاء مجموعات بيانات ثلاثية الأبعاد معقدة تم حلها زمنيا وتتطلب طرقا لاستخراج هذه المعلومات الكمية. هنا نصف تطورنا الإضافي ل24 ماكرو المستندة إلى ImageJ والتي يمكن استخدامها لتصحيح الانجراف في الهايبرستاكس ووحدات الماكرو ImageJ المصنوعة خصيصا التي تسمح بالكم شبه الآلي للفلورسنس متعدد القنوات في قشرة الخلية التي تم تطويرها لتحديد البروتينات القشرية في الخلايا العصبية لأدمغة يرقات Drosophila أو الخلايا العصبية الفردية في زراعة الخلايا الأولية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila هو نظام نموذجي مهم لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يمكن استخراج الأعضاء والأنسجة المختلفة من مراحل النمو المختلفة للذبابة مثل الأقراص التصويرية أو الدماغ اليرقاني أو غرف البيض للإناث البالغات أو الأمعاء البالغة والاحتفاظ بها في الثقافة للتصوير بالمنظار الدقيق الفاصل زمنيا ، مما يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا الخلية والتطور. هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكولنا الحالي لتشريح أدمغة يرقات دروسوفيلا ، ثم نقدم نهجنا الحالي لشل وتوجيه أدمغة اليرقات والأنسجة الأخرى على غطاء زجاجي باستخدام جلطات فيبرين. تتطلب طريقة التجميد هذه إضافة الفيبرينوجين والثرومبين إلى وسيط الثقافة. وهي مناسبة للتصوير الفاصل الزمني عالي الدقة على المجاهر المقلوبة لعينات متعددة في طبق الثقافة نفسه ، وتقلل من الانجراف الجانبي الناجم في كثير من الأحيان عن حركات مرحلة المجهر في المجهر الزائر متعدد النقاط ويسمح بإضافة وإزالة الكواشف أثناء التصوير. كما نقدم وحدات الماكرو حسب الطلب التي نستخدمها بشكل روتيني لتصحيح الانجراف واستخراج ومعالجة معلومات كمية محددة من تحليل الفاصل الزمني.

تعطيل أنسجة دروسوفيلا مع جلطات فيبرين وتبادل متوسط الثقافة أثناء التصوير الحي. بعد تشريحها بعد الإجراء المقدم في الخطوة 2(الشكل 1)وشل حركتها في جلطات فيبرين على نفس الغطاء بعد الإجراء المقدم في الخطوة 3 (الشكل 2) ، تم تصوير أدمغة اليرقات التي تعبر عن بازوكا الموسومة ب GFP (Baz::GFP) ، وتقويم ذبابة بروتين القطبية Par-3 ، لمدة 30 دقيقة في التصوير confocaling متعدد المواضع. Baz::GFP هو جنبا إلى جنب مع APKCas4, أليل التي تسمح تثبيط الحادة من بروتين غير نمطي كيناز C (APKC) من خلال إضافة ATP التناظرية الصغيرة 1-NAPP120. 1-NAPP1 ولذلك أضيف إلى ثقافة المتوسطة بعد الإجراء المقدم في الخطوة 4 واستؤنف التصوير الحي لمدة 2.5 ساعة. السيطرة على العقول التي تحمل نسخة من نوع البرية من aPKC كيناز لم تتفاعل مع التناظرية ATP، في حين أن العقول تحمل بالإضافة إلى طفرة التناظرية الحساسة من aPKC (APKCas4) عرض انكماش الظهارة العصبية ومجموعات مشرقة من الباز في الخلايا العصبية وذرية بهم ( الشكل6، فيديو 1). تستمر الخلايا العصبية في الانقسام طوال الفاصل الزمني ، مما يشير إلى أن الأنسجة لا تزال صحية ، وتظهر الأدمغة القليل من الانجراف على الرغم من التغير المتوسط للثقافة ، مما يشير إلى أنها مشلولة بشكل جيد. وبالمثل، بعد تشريحها بعد الإجراء المقدم في27، ovarioles التعبير عن باز::تم شل حركة GFP في جلطات فيبرين على نفس coverslip وصورت لمدة 8 دقائق، وبعد ذلك تطبيق 1-NAPP1 تسبب تقلص الخلايا الجريبية APKCas4 متحولة ولكن ليس من الضوابط (الشكل 7، فيديو 2).
تصحيح الانجراف الجانبي والتركيز باستخدام MultiHyperstackReg. A hyperstack عرض الانجراف الجانبي والتركيز على حد سواء(فيديو 3, لوحة اليسار) تم تصحيحها لأول مرة للانجراف الجانبي (الخطوة 6.2, الشكل 3, فيديو 3, لوحة الأوسط), ثم التركيز الانجراف (الخطوة 6.3, الشكل 4, فيديو 3, لوحة الحق) باستخدام البرنامج المساعد MultiStackReg والكلية MultiHyperstackReg, مما أدى إلى انخفاض كبير في الحركات التي لوحظت في hyperstack الأصلي.
قياس الإشارات القشرية باستخدام اركان الخطوط الدوارة تم تصوير الأرومة العصبية التي تعبر عن باز::GFP (الأخضر) وبروتين ترانسميمبران CD4 الموسوم ببروتين فلوري بالأشعة تحت الحمراء (CD4::mIFP، أحمر) خلال ميتوسيس واحد. تم استخدام إشارة CD4::mIFP كمرجع للكشف عن القشرة في أجزاء مختلفة من الأرومة العصبية مع البقان (الخطوة 7، الشكل 5، الشكل 8A-C)وتم قياس إشارة Baz::GFP في المواقع المكتشفة الشكل 8D). خلال تقسيمها ، استقطبت الخلايا العصبية بشكل عابر من خلال إنشاء مجالات قشرية متميزة ومضاكسة: القطب apical والقطب القاعدي. الباز يحدد القطب apical و, باستمرار, الباز::GFP إشارة زيادة في القطب apical من neuroblast وانخفض في القطب القاعدي خلال الانقسام (الشكل 8C,D). تم تتبع موقف القشرة بشكل مرض طوال الفاصل الزمني (الشكل 8C، فيديو 4). خطوط Drosophila والأنماط الجينية المشار إليها في الجدول التكميلي 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> الشكل 6: تطبيق تناظرية ATP على أدمغة اليرقات المشلولة أثناء التصوير الحي. (أ)التصوير الحي لأدمغة يرقات اثنين تعبر عن Baz::GFP معطلة على نفس الغطاء. يتم تغيير وسيط الثقافة إلى تركيز 10 ميكرومتر من ATP التناظرية 1-NAPP1 في 0 دقيقة. السيطرة على العقول لا تتفاعل بشكل واضح لATP التناظرية في حين أن العقول تحمل طفرة حساسة التناظرية من APKC(APKCAS4)عرض انكماش الظهارة العصبية (رؤوس الأسهم) ومجموعات مشرقة من الباز في الخلايا العصبية ذريتها. الحد الأقصى لشدة الإسقاط من 33 شرائح لعمق 23 ميكرومتر. شريط مقياس: 20 ميكرومتر (ب) تكبير الظهارة العصبية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> الشكل 7: تطبيق التناظرية ATP على غرف البيض معطلة أثناء التصوير الحي. التصوير الحي لاثنين من ovarioles التعبير عن باز::GFP شلت على نفس coverslip. يتم تغيير وسيط الثقافة إلى تركيز 10 ميكرومتر من ATP التناظرية 1-NAPP1 في 0 دقيقة. غرف البيض التحكم لا تتفاعل بشكل واضح مع التناظرية ATP في حين أن غرف البيض تحمل طفرة حساسة التناظرية من aPKC (aPKCAS4) عرض انكماش الظهارة (رؤوس الأسهم) مما يؤدي في نهاية المطاف إلى انهيار واضح من تقاطعات adherens. أقصى كثافة الإسقاط من 33 شرائح لعمق 27 ميكرومتر شريط مقياس: 20 ميكرومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> الشكل 8: قياس الإشارة القشرية باستخدام الخطوط الدوارة. (أ)لايف D. melanogaster neuroblast التعبير عن باز::GFP (الأخضر) وCD4::mIFP (أحمر). خطوط سماوية: خطوط المسح الأولي تتبع عموديا إلى مناطق القشرية المختلفة لقياس. شريط المقياس: 5 ميكرومتر (ب) تحديد القشرة (الخط الأزرق الداكن) باستخدام الخطوط القشرية وCD4::mIFP (أحمر) كقناة مرجعية. خط سماوي: المنطقة المحددة بواسطة المعلمة "قياس حول" (هنا، 2 بكسل)، حيث يتم قياس الإشارة بعد الكشف عن القشرة. شريط المقياس: 2 ميكرومتر (C) سماوي: المناطق القشرية التي تم تحديدها أثناء تقسيم الأرومة العصبية بواسطة طريقة الخطوط الدوارة من خطوط المسح الأولية المعروضة في (A)، باستخدام CD4:mIFP (أحمر) كقناة مرجعية. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. السهم: القطب apical. رأس السهم: القطب القاعدي. (D) قياس Baz::GFP شدة الإشارة مع مرور الوقت في المنطقتين المقابلة التي حددتها linescans الدورية المعروضة في (C). خلال الانقسام، Baz::GFP يحصل على إثراء عابر في القطب apical من الأرومة العصبية واستنفدت من القطب القاعدي المعاكس. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
فيديو 1: تطبيق تبادل الوسائط على أدمغة اليرقات المشلول أثناء التصوير الحي لإضافة مثبط ، معروض في الشكل 6، شريط المقياس: 20 ميكرومتر. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.</a>
فيديو 2: تطبيق تبادل الوسائط على غرف البيض المشلوم أثناء التصوير الحي لإضافة مثبط ، معروض في الشكل 7، شريط المقياس: 20 ميكرومتر. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.</a>
فيديو 3: تصحيح الانجراف الجانبي والتركيز باستخدام MultiHyperStackReg. التصوير الحي لخلايا الأرومة العصبية التي تعبر عن مسبار الغشاء PH::GFP. Xy: مستوى بؤري واحد. Xz: إعادة تشريح متعامدة. إلى اليسار: قبل تصحيح الانجراف. الوسط: بعد تصحيح الانجراف الجانبي. الحق: بعد التصحيح الانجراف الجانبي والتركيز، شريط مقياس: 10 μm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
فيديو 4: الكشف عن القشرة باستخدام linescans الدورية، المقدمة في الشكل 8،شريط مقياس: 5 ميكرومتر. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
الجدول التكميلي 1: الأنماط الجينية لأنسجة دروسوفيلا المصورة. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول التكميلي 2: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
ملف الترميز التكميلي 1: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
ملف الترميز التكميلي 2: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
ملف الترميز التكميلي 3: أصل المتحولين جنسيا المستخدمة. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

يصف هذا البروتوكول تطبيقات تعطيل العينة باستخدام جلطات الفيبرين، والحد من الانجراف، والسماح بإضافة الكواشف وغسلها أثناء التصوير الحي. يتم نقل العينات إلى قطرة من الفيبرينوجين تحتوي على وسيطة الثقافة على سطح غطاء، وبعد ذلك يتم تحريض البلمرة عن طريق إضافة الثرومبين.

تطبيقات شل حركة أنسجة الدروزوفيلا مع جلطات فيبرين للتصوير الحي

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Views.  University of Dundee. يصف هذا البروتوكول تطبيقات تعطيل العينة باستخدام جلطات الفيبرين، والحد من الانجراف، والسماح بإضافة الكواشف وغسلها أثناء التصوير الحي. يتم نقل العينات إلى قطرة من الفيبرينوجين تحتوي على وسيطة الثقافة على سطح غطاء، وبعد ذلك يتم تحريض البلمرة عن طريق إضافة الثرو...

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

في المختبر تمايز الناضجة Myofibers للتصوير لايف

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

تطبيقات شل حركة أنسجة الدروزوفيلا مع جلطات فيبرين للتصوير الحي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

يعيش التصوير لل