يجمع البروتوكول بين قوة توليد أنواع خلايا القلب والأوعية الدموية البشرية باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات وتقنية متعددة الاستخدامات لتوليد كرويات القلب الضاربة في أقل من 72 ساعة. يمكن استخدام هذه الكرويات القلبية لنمذجة الأمراض واختبار المخدرات. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية السهلة هي أنه يمكن للمرء أن يولد ما يقرب من 1000 كروية قلبية تنبض في لوحة قياسية من 12 بئرا.
والأهم من ذلك ، يمكن فحص كل كروي قلبي لوظيفته الانقباضية باستخدام تقنية قائمة على التصوير. بعد إذابة الأغاروز في الميكروويف ، ضعه في خزانة السلامة البيولوجية واتركه ليبرد لمدة ثلاث دقائق. ماصة 700 ميكرولتر من الأغاروز المنصهر وإضافته إلى القالب الدقيق السيليكون من مصفوفة تسعة في تسعة ، مع الحرص على تجنب توليد فقاعات.
ضع القالب بعناية على كتلة الثلج قبل التبريد لتسريع مدة الأغارو. بمجرد أن يصبح الأغاروز شفافا ، قم بثني حواف القالب الدقيق بعناية لفقدان نسخة الأغاروز المتماثلة وتقشير النسخة المتماثلة بلطف من جميع الجوانب لفصلها عن القالب الدقيق السيليكوني. انقل صينية الأنسجة الدقيقة الأغاروز التي تحتوي على 81 استراحة دائرية إلى صفيحة معقمة من 12 بئرا ، ثم أضف ملليلتر من PBS إلى صينية الأنسجة الدقيقة الأغاروز ، وافحصها تحت المجهر بحثا عن أي فقاعات محاصرة أو آبار غير منتظمة الشكل.
اغمر صينية الأغاروز في ملليلترين من الإيثانول بنسبة 70٪ بين عشية وضحاها ، تليها المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ واغسله مرتين بالماء المقطر ، ومرة واحدة بملليلتر من PBS. بمجرد حساب الخلايا العضلية القلبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا العضلية القلبية والخلايا الليفية القلبية والخلايا البطانية بعد التربسين والتحييد ، ضع معلقات الخلايا على الجليد.
في أنبوب جديد، امزج الخلايا العضلية القلبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة، والخلايا الليفية القلبية، والخلايا البطانية. ثم ، قم بإزالة PBS من البئر وغرفة بذر الخلايا دون لمس الاستراحات ، وأضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية قطرة. اسمح للخلايا بالاستقرار عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.
أضف وسط تصنيع الأنسجة الدقيقة المحيطة بقالب الأغاروز لتغطية سطح الغرفة الداخلية. بعد 24 ساعة ، راقب الكرويات ذاتية التجميع والمدمجة في الاستراحات الدائرية. تغيير الوسط كل يومين للحفاظ على الكروية.
عادة ، بعد 48 ساعة ، يمكن ملاحظة الضرب التلقائي للكرويات. قم بزراعة أنواع الخلايا الفردية بشكل منفصل على وسط مصفوفة الغشاء السفلي ، أو شرائح الغرفة المطلية بالجيلاتين. اطرد الأنسجة الدقيقة القلبية بلطف من الاستراحات الدائرية ، واجمعها في أنبوب سجل 15 ملليلتر.
شفط الوسط وشطف الخلايا أو الأنسجة الدقيقة ، مع ملليلتر واحد من PBS. ثم ، قم بإصلاح الخلايا أو الأنسجة الدقيقة باستخدام مخزن مؤقت للتثبيت يحتوي على 4.2٪ PFA واحتضنها في درجة حرارة الغرفة. استنشاق PFA واحتضان الخلايا أو الأنسجة الدقيقة مع ملليلتر واحد من محلول التغلغل.
ثم ، استنشق المحلول وشطفه بملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من PBS. أضف 500 إلى 1000 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الخلايا واحتضنها لمدة ساعة واحدة على الأقل لشرائح الغرفة ، ولمدة ثلاث إلى أربع ساعات للأنسجة الدقيقة. احتضان العينات بأجسام مضادة مقترنة في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة لشرائح الغرفة ، وبين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية للأنسجة الدقيقة القلبية.
اغسل شرائح الغرفة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من 0.1٪ Tween 20 ، مع فترات خمس دقائق بين كل غسل ، ثم قم بإجراء غسل نهائي باستخدام PBS. اغسل الأنسجة الدقيقة القلبية خمس مرات بملليلتر من 0.1٪ Tween 20 ، مع مدة 20 دقيقة بين كل غسلة. ثم ، قم بإجراء غسل نهائي لمدة 20 دقيقة إضافية.
احتضن الخلايا أو الأنسجة الدقيقة باستخدام DAPI قبل الفحص المجهري البؤري ، ثم انقل الأنسجة الدقيقة القلبية بعناية إلى طبق سفلي زجاجي 35 ملم ، وأضف PBS لغمر الأنسجة الدقيقة. اطرد الأنسجة الدقيقة من الاستراحات الدائرية بأخرى متوسطة باستخدام طرف ماصة عريض أو ملليلتر واحد في أنبوب مزمن سعة 15 ملليلتر ، واسمح لها بالاستقرار. ثم ، استنشق الوسط وشطفه بملليلتر واحد PBS.
أضف 200 إلى 300 ميكرولتر من مخزن هضم الإنزيم العازل واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم امزج الأنسجة الدقيقة بلطف لمدة دقيقة واحدة ، وكرر الحضانة. بعد الحضانة ، امزج الأنسجة الدقيقة بقوة مع طرف ماصة عادية بملليلتر واحد لهضمها في خلايا مفردة.
احصل على تعليق خلية عكر ، وقم بتحييد تعليق الخلية على الفور باستخدام خمسة ملليلترات من الوسط الذي يحتوي على 5٪ FBS. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا. الطرد المركزي للتعليق أحادي الخلية عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
قم بشفط المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت المرتبط بالملحق مع FITC Annexin V ويوديد البروبيديوم ، أو صبغة استبعاد الخلايا الميتة TO-PRO-3 ، واحتضنها لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد الحضانة ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط بالملحق إلى تعليق الخلية وانقله إلى أنبوب FACS مستدير القاع لتحليل التدفق الخلوي. تم تصوير الخلايا العضلية القلبية المستحثة المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا العضلية القلبية والخلايا البطانية والخلايا الليفية القلبية باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.
تم تحديد نقاء أنواع الخلايا المختلفة باستخدام تلطيخ المناعة وقياس التدفق الخلوي. تم استخدام Troponin T كعلامة للخلايا العضلية القلبية ، وتم تحقيق نقاء أكثر من 90٪. تم استخدام جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية CD31 و vimentin كعلامات للخلايا البطانية والخلايا الليفية القلبية ، وأشار إلى النقاء أكثر من 98 و 96 ٪ على التوالي.
كشف تلطيخ التألق المناعي أن الخلايا العضلية القلبية كانت الأثقل واحتلت مركز الأنسجة الدقيقة ، في حين كانت الخلايا البطانية تتخللها الأنسجة الدقيقة ، وكانت الخلايا الليفية القلبية تحتل في الغالب المحيط. أدى هضم الأنسجة الدقيقة باستخدام هذه الوتيرة الأولى و Liberase TL إلى نسب خلايا قابلة للحياة للغاية مع عدد أقل من الخلايا الماصة بعد أسبوعين في الثقافة. التعرض لمدة ساعة واحدة من الأنسجة الدقيقة القلبية لتركيز عال من دوكسوروبيسين الناجم عن جرعة تعتمد على سمية القلب.
أدى انقباض الأنسجة الدقيقة وحركة المتجهات إلى إنشاء خريطة حرارية زائفة توضح متوسط ملف تعريف الانكماش عبر الأنسجة الدقيقة. ولدت الحركة الانقباضية للأنسجة الدقيقة القلبية قمم إيجابية تم قياسها على أنها سرعة الانقباض ، وسرعة الاسترخاء ، ومعدل النبض ، والذي تم حسابه كوقت بين دورتي انقباض. كان انقباض الأنسجة الدقيقة القلبية ثابتا على مدى أربعة أسابيع في الثقافة.
يعد تسخين الخلايا أحد أهم الخطوات في هذا البروتوكول بالذات ، حيث يجب على المرء أن يحرص على توزيع تعليق الخلية بعناية في مصفوفة الأغاروز للتوزيع المتساوي داخل الآبار الدقيقة ، ومنع الفيضان. باستخدام بروتوكول الإشعاع الأمثل لهذه الأنسجة الدقيقة ، يمكن للمرء أن يخضع هذه التقنيات لتسلسل الإنتاجية العالية ، مثل RNA-seq أحادي الخلية أو ATAC-seq أحادي الخلية لفهم أنماط التعبير الجيني الخاصة بالخلية الناتجة عن ظروف العلاج المختلفة.
