يصف هذا البروتوكول التقنيات التي يمكن استخدامها من قبل علماء فسيولوجيا الحيوانات الصغيرة لتوضيح دور الببتيدات العصبية والعوامل الهرمونية الأخرى التي تنظم الجهاز الهضمي و / أو الإخراجي. تسمح هذه التقنيات بقياسات العينات البيولوجية ذات الحجم الجزئي التي لن تكون ممكنة باستخدام تقنيات مصممة خصيصا للنماذج الحيوانية الأكبر ، بما في ذلك ، على سبيل المثال ، القوارض والتيليوس. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على تنظيم الغدد الصماء في الأمعاء ، بما في ذلك نقل العضلات الظهارية ، وكذلك العضلات الملساء المرتبطة بالجهاز الهضمي في الحشرات وفي الأنواع غير الحشرية ذات الحجم المماثل.
ستوضح إجراءات البوق الكلوي للحشرات فروة سجادي ، مرشحة الدكتوراه من مختبري. بالإضافة إلى ذلك ، سيقوم طالب دراسات عليا سابق من مختبري آريان لاجيفاردي بعرض البروتوكولات التي تركز على الأمعاء الخلفية. ابدأ بإعداد أطباق رامزي وفحوصات الانكماش للتجارب.
استخدم ماصة واملأ الآبار بما يصل إلى 20 ميكرولتر من المحلول. للحصول على عناصر تحكم غير محفزة ، املأ الآبار ب 20 ميكرولتر من وسط شنايدر المالحة الزاعجة. بمجرد ملء جميع الآبار ، صب الزيت المعدني المائي في طبق الفحص حتى يتم غمر الآبار ودبابيس Minutien.
بعد غمر النبيب في البئر ، التقط الطرف القريب من النبيب باستخدام ملقط ، وقم بإزالته من قطرة الاستحمام ، ولف النهاية حول الدبوس. لف النبيب حول الدبوس مرتين مع الحفاظ على طول النبيب المتبقي في قطرة الاستحمام بما يتفق مع الأنابيب الأخرى. لصنع قطب دقيق انتقائي للصوديوم ، استخدم حقنة ملليلتر واحدة لردم القطب الكهربائي بكلوريد الصوديوم 100 ملليمولار.
تأكد من ملء محلول الردم حتى طرف القطب الكهربائي. إذا ظهرت فقاعات الهواء ، فقم بتحريك القطب الدقيق بلطف أو قم بإزالة المحلول وإعادة تعبئته. اغمس طرف ماصة 10 ميكرولتر في محلول الأيونوفور الانتقائي للصوديوم.
اصطف القطب عموديا على الماصة ، ثم ضع إصبعا قفازا فوق الجزء السفلي من الطرف لخلق ضغط وطرد قطرة صغيرة من الأيونوفور. المس بعناية قطرة الأيونوفور إلى طرف القطب الدقيق ، مع التأكد من عدم كسرها. املأ دورقا صغيرا في منتصف الطريق بكلوريد الصوديوم 100 ملليمولار وضع بعض طين النمذجة في الداخل في الجزء العلوي من الدورق.
بعد أخذ الأيونوفور ، ضع طرف القطب الكهربائي على جدار الكأس ، واترك الأطراف داخل كلوريد الصوديوم. احتفظ ب ISME في الكأس حتى يصبح جاهزا للاستخدام. لجعل القطب المرجعي ISME ، ردم قطب كهربائي مع كلوريد البوتاسيوم 500 ملليمولار وتخزينه في دورق.
قم بتغطية أطراف القطب باستخدام محلول يحتوي على حوالي 3.5٪ من كلوريد البولي فينيل ، المذاب في رباعي هيدروفوران ، لتجنب إزاحة الأيونوفور عند غمره في زيت البارافين. لمعايرة قطب الصوديوم ، ضع 10 قطرات ميكرولتر من تركيزات كلوريد الصوديوم القياسية على حافة طبق Ramsey مع أنابيب Malpighian المحتضنة. ضع القطرات القياسية على بعد سنتيمترين مع التركيز العالي في الأعلى.
أدخل كل من القطب المرجعي والقطب الانتقائي الأيوني فوق أسلاك فضة الكلوريد واربطها بإحكام باستخدام حوامل الأقطاب الكهربائية المتصلة بالمتلاعبين الصغار. قم بالتنقل بين كلا القطبين نحو قطرة كلوريد الصوديوم التي تبلغ سعتها 200 ملليمولار باستخدام المتلاعبين الدقيقين ، مما يضمن عدم لمس الأطراف الكهربائية لأسفل الطبق. قم بتشغيل المقياس الكهربائي لبدء التسجيل واسمح للقراءة بالاستقرار.
سجل القراءة واستمر إلى المعيار التالي. بعد الحصول على قياسات لمعدل إفراز السائل ، حرك بعناية الأقطاب الكهربائية الانتقائية المرجعية والأيونية إلى القطرة المفرزة باستخدام المتلاعبين الصغار. قم بتشغيل التسجيل واسمح للقراءة بالاستقرار، ثم قم بالتسجيل.
قم بتشغيل مكبر الصوت IPA-2 Ion/Polarographic ومجهر الضوء وأجهزة الكمبيوتر. ضع القطب الدقيق الانتقائي للصوديوم على حامل يتكون من سلك كلوريد الفضة وقم بتوصيله بمقبس الموصل الأنثوي. قم بإزالة قطب مرجعي واحد من الكأس باستخدام كلوريد البوتاسيوم ، ووضع إصبع واحد في أحد طرفيه وإمالة الشعيرات الدموية الزجاجية نحو هذا الإصبع لمنع سقوط الآجار.
ضع جانبا بعناية في الحامل ، مع ضمان عدم تشكل فقاعات. إذا كانت هناك فقاعة ، فقم بإزالة القطب المرجعي ، وأعد ملء الحامل بثلاثة كلوريد بوتاسيوم مولي وكرر. ضع حامل القطب الكهربائي في مقبس الموصل الأنثوي.
بعد المعايرة ، تشريح الجهاز. ضع طبق بولي-إل-ليسين مع العينة المشوهة على مرحلة المجهر وأدخل طرف القطب المرجعي داخل المحلول الملحي. اغمر طرف القطب الدقيق الانتقائي الأيوني في المحلول الملحي ، مع الحرص على عدم كسر الطرف.
استخدم مقابض الضبط اليدوية لضبط موضع القطب الدقيق أثناء النظر تحت المجهر الضوئي. اضبط الوضع الرأسي للقطب الدقيق بحيث يكون طرفه على نفس مستوى العضو أو النسيج ، ثم أدر مفتاح المحرك للتمكين. باستخدام مفاتيح أسهم الكمبيوتر، حرك القطب الدقيق أفقيا إلى موضع يبعد ثلاثة ملليمترات عن الأنسجة لقياس تسجيلات الخلفية.
عندما تكون جاهزا، ابدأ التسجيل بالضغط على F5، واحصل على خمسة قياسات لنشاط الخلفية. حرك طرف القطب الدقيق بالقرب من الأنسجة مع الحرص على عدم اختراق العضو. قلل من حساسية الضربة الرئيسية لوضع طرف القطب الدقيق على بعد ميكرومترين مباشرة إلى اليمين ، عموديا على الأنسجة.
احصل على ثلاثة تسجيلات في الموقع على طول لوحة المستقيم لتحديد موقع أكبر نشاط أيوني ، ثم احصل على قياسات ملحية أساسية في الموقع الذي يعرض أكبر نشاط. لتسجيل تقلصات الأمعاء الخلفية ، املأ أحد الآبار في الطبق بحجم معروف من الزاعجة المالحة. بعد التشريح ، انقل بعناية القناة الهضمية الخلفية المشوهة المرتبطة بالأمعاء الوسطى إلى بئر في طبق آخر ، مع التأكد من عدم قرصة الدقاق.
غمر الأمعاء في المياه المالحة داخل البئر ووضع دبابيس Minutien في الأمعاء الوسطى والمستقيم. لا ينبغي أن يكون الدقاق تحت التوتر ويجب ملاحظة الانقباضات التلقائية التي تنشأ في صمام البواب في الدقاق الأمامي. قم بتوصيل كاميرا الفيديو بالمجهر المجسم.
ثم ضع الطبق الذي يحتوي على العضو التشريحي تحت المجهر وسجل مقطع فيديو لمدة دقيقتين. يؤدي تطبيق DH31 ضد أنابيب Malpighian غير المحفزة إلى زيادة كبيرة في معدل إفراز السوائل ، مما يؤكد دوره كهرمون مدر للبول في بعوض الزاعجة. عندما يتم التعامل مع الأنابيب باستخدام AedaeCAPA-1 ، لوحظ انخفاض في معدل الإفراز في أنابيب Malpighian المحفزة DH31.
تم استخدام أقطاب كهربائية انتقائية أيونية لقياس تركيزات الصوديوم في القطرات المفرزة. لم يكن لعلاج DH31 على MTs أي تأثير على تركيز الصوديوم في القطرة المفرزة. ومع ذلك ، مع تطبيق AedaeCAPA-1 ، زاد تركيز الصوديوم في السائل المفرز بشكل كبير.
بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الضوابط غير المحفزة ، أدى DH31 إلى معدل نقل صوديوم أكبر بكثير ، في حين ألغى AedaeCAPA-1 هذه الزيادة في الأنابيب المحفزة DH31. تم استخدام SIET لتقييم التغيرات في نقل الصوديوم على طول ظهارة وسادة المستقيم لإناث البعوض البالغة. تم استخدام تناظرية ليوكوكينين لفحص التغيرات في امتصاص الصوديوم ، مما أدى إلى انخفاض أربعة أضعاف في امتصاص الصوديوم مقارنة بالتحكم في محلول ملحي.
لتقييم دور بيروكينين نيوروببتيد 2 على الحركة اللفائفية ، تم استخدام نظير رودنيوس بروليكسوس ، والذي ثبت سابقا أنه ينشط مستقبل A.aegypti PK2 المخصب في دقاق البعوض. بالنسبة لمستويات خط الأساس ، يمنع PK2 بشكل كبير الانقباضات اللفائفية. عند إجراء فحص رامزي باستخدام أنابيب Malpighian وقياس معدلات إفراز الأيونات أو السوائل ، من الضروري عدم تلف الأنابيب أثناء التشريح أو أثناء النقل إلى طبق الفحص.
بعد فحص رامزي ، يمكن استهداف ناقلات غشائية محددة إما دوائيا أو جزيئيا باستخدام تقنيات وراثية عكسية لتمييز مساهمتها المحددة في النقل عبر الظهارة للمذابات في الظهارة البسيطة.
